一、材料：拟南芥

二、基因型：WT、转基因1、转基因2

三、处理：200mM NaCl处理

四、检测指标：Na+

五、检测部位：根分生区（过渡区中间）  

六、具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）

【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】

一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。  

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.置于200mM NaCl中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组  

（例如：200mM NaCl处理半小时，测试液50mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH6.0，不需要平衡，放入测试液中直接开始测）

一、材料：拟南芥

二、基因型：WT、转基因1、转基因2

三、处理：200mM NaCl处理24h

四、检测指标：Na+，K+

五、检测部位：根分生区（过渡区中间）  

六、具体方案：  

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】 一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少        

1）对照组 置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a. 200mM NaCl胁迫后，立即检测（200mM NaCl实时处理）

b.置于200mM NaCl中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组（200mM NaCl预处理24h）  

注意：测K+直接在胁迫浓度里测即可，例如测试液：200mM NaCl，0.1 mM KCl，0.1mM CaCl2，pH6.0

一、   材料：拟南芥

二、   基因型：WT、转基因1、转基因2

三、   处理：200mM NaCl处理24h

四、   检测指标：Na+

五、   检测部位：根伸长区

六、   具体方案：

【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

置于200mM NaCl中处理24h后，记录10分钟，8重复/组

测试液：0.5mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH6.0

一、   材料：拟南芥

二、   基因型：WT、转基因1、转基因2

三、   处理：10mM NH4Cl处理24h

四、   检测指标：NH4+

五、   检测部位：根成熟区

六、   具体方案：

置于10mM NH4Cl中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组

测试液：0.1mM NH4Cl，0.1 mM CaCl2，pH6.0

铵外排检测时的样品平衡时间需要尝试，比如平衡20min检测一下、平衡40min检测一下，看看平衡多久能检测到持续稳定的铵外排。

一、   材料：2种茶树

二、   处理：
1）0.01 mM CdCl2瞬时处理
目的：Cd实时处理后，Cd2+吸收和H2O2的信号相对较强，有利益观察不用材料间的差异

2）0.01 mM CdCl2处理12h、48h（时长可调整）
目的：观察Cd长时处理效应

3）0.1 mM CdCl2瞬时处理（浓度可调整）
4）0.1 mM CdCl2处理12h、48h（时长可调整）

三、   检测指标：Cd2+

四、   检测位点：根

（根部Cd定点位置统计：分生区52.94%、伸长区41.18%、成熟区23.53%、根冠11.76%；根部Cd定点优先位置：伸长区）

五、   具体实验细节：
1、Cd2+
1）瞬时处理后建议检测时长为30分钟，根据前2个样品的实际信号变化情况，可现场优化检测时长。

2）12h、48h处理后，检测10分钟稳定数据即可

六、   参考文献
https://mp.weixin.qq.com/s/ghdDSYJqyha59A5_BYFCJg

一、   材料：水稻

二、   基因型/品种：1个对照、1个过表达株系、1个RNAi株系

三、   检测指标：NH4+、NO3-

四、   检测位点：根

五、   重复：8

六、   处理

1. 正常NH4NO3处理3d
2. 低NH4NO3处理3d
3. 高NH4NO3处理3d

【具体方案】

1. 扫点实验：对照样品选取4个重复进行扫点实验，具体检测位点

300μm、800μm、1500μm、2500μm、7500μm，15000μm每个点检测3min

2. 定点实验：根据扫点实验结果，选择NH4+、NO3-吸收最大的点进行定点实验，每个点检测5min

测试费用报价：

扫点：

1（基因型）×1（处理）×1（指标）×6（位点）×4（重复）×132元/样（定点3min）

定点：

3（基因型）×2（指标）×3（实验组）×8（重复）×195元/样（定点：5min）

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant、OE

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

1. 无处理

2. 10 mg/mL chitin处理 24h

3. 病原菌处理24h

4. 10 mg/mL chitin瞬时处理

5. 病原菌瞬时处理

六、具体方案：

处理1、2、3：无处理、10 mg/mL chitin处理24h、病原菌处理24h后，定点检测叶肉细胞10min，8重复/组

处理4、5：10 mg/mL chitin、病原菌处理前检测5min，10 mg/mL chitin、病原菌处理后，检测10分钟（如信号在瞬时处理后10分钟内没有稳定，会延长测试时间），8重复/组

参考文献

保卫细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/YovUAnqOYkIViXUHe0dFWw

叶肉细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/0UZ_cqxDL_zBxQZz4ok7Pg

测试费用报价：

3（基因型）*1（测试指标）*1（测试部位：根）*1（处理方式：chitin瞬时）*8（重复数）*470

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant、OE

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

1. 无处理

2. 10 mg/mL chitin处理 24h

3. 病原菌处理24h

4. 10 mg/mL chitin瞬时处理

5. 病原菌瞬时处理

六、具体方案：

处理1、2、3：无处理、10 mg/mL chitin处理24h、病原菌处理24h后，定点检测叶肉细胞10min，8重复/组

处理4、5：10 mg/mL chitin、病原菌处理前检测5min，10 mg/mL chitin、病原菌处理后，检测10分钟（如信号在瞬时处理后10分钟内没有稳定，会延长测试时间），8重复/组

参考文献

保卫细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/YovUAnqOYkIViXUHe0dFWw

叶肉细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/0UZ_cqxDL_zBxQZz4ok7Pg

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant、OE

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

4℃瞬时处理

六、具体方案：

4℃处理前检测5min，4℃处理后，检测10分钟（，8重复/组

一、 材料：拟南芥

二、 基因型：WT、OE

二、检测部位：保卫细胞

三、检测指标：Ca2+、K+、H+

四、处理：

1. 对照

2. 自然干旱胁迫10天

五、具体方案

定点检测5分钟，8重复/组

测试液：2.0mM KCl+0.1mM CaCl2+5.0mM MES，pH6.0（可测K、Ca、H、Cl）

平衡时间：如果检测气孔打开的，照光（10000~20000lux）平衡1h

一、材料：拟南芥

二、品种：WT、mutant

三、检测部位：根内皮层细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理

1 μM Flg22瞬时处理

六、具体方案：

1 μM Flg22瞬时处理前检测5分钟，1 μM Flg22瞬时处理后检测10min，8重复/组

测试液：0.1mM CaCl2, pH 6.0

平衡时间：4 h

一、材料：大白菜
二、基因型/品种：转基因、WT
三、检测部位：根分生区（H+）、根成熟区（Cd2+）
四、检测指标：H+、Cd2+
五、处理：
1)  CK

2)  200mM NaCl处理 2d

六、具体方案：
1. H+、Cd2+
200mM NaCl处理2d后，定点检测10分钟，8重复/组


【参考视频】
1.如何利用非损伤微测系统（NMT）进行Fe2+营养研究？（检测Cd2+的原因）
https://tv.sohu.com/v/dXMvMjQ0NTI0MjEyLzk2MDUxMzEwLnNodG1s.html
有研究发现Fe2+、Zn2+的转运用的都是同一个转运蛋白，该蛋白同时还能转运Cd2+，因为无法直接测Fe2+，那么检测Cd2+流速，如果是吸收的，间接证明了Fe2+也是吸收的，再结合ICP-MS等类似实验，检测植物体内的离子含量，也可以验证Fe2+的吸收。


2.如何通过检测H+流研究植物Fe营养？（检测H+的原因）
https://v.qq.com/x/page/p0521l0uc4t.html
缺铁的情况下，植物为了吸收更多的铁（土壤里的铁都是三价的），会诱导一些ATP酶，把ATP酶放在质膜上诱导生成更多的H+，然后根系泌H+，土壤酸化，三价铁再高铁还原酶的作用下被还原成二价铁，再被吸收。


【参考文献】
C2014-013
标题：Over-expression of the MxIRT1 gene increases iron and zinc content in rice seeds

【方案一：预处理（长时处理）】

1. 材料：柚木（不接种真菌、接种真菌1、接种真菌2）
2. 处理：干旱胁迫（自然干旱）
3. 检测指标：Ca2+、H2O2
4. 检测位点：根
5. 重复：8
6. 具体实验内容

自然干旱10d（时间点可调整）后，定点检测柚木根部5min

【方案二：实时处理】

1. 材料：柚木（不接种真菌、接种真菌1、接种真菌2）
2. 处理：干旱胁迫（20%PEG模拟干旱胁迫，浓度可调整）
3. 检测指标：Ca2+、H2O2
4. 检测位点：根
5. 重复：8
6. 具体实验内容

1. 10%PEG处理前检测5min，10%PEG处理后检测10min

实验目的：干旱胁迫条件下，研究接种丛枝菌根真菌能否促进植物根系过氧化氢的外排以减轻植物的氧化胁迫

实验1—预处理

目的：观察NaHCO3长时处理效应，以及外源钙对碱胁迫下离子平衡的影响。

1. 检测样品：油菜
2. 样品品种：碱敏感品种、耐碱品种
3. 检测部位：叶绿体、叶肉细胞
4. 处理方式：

1. CK
2. 75mM NaHCO3
3. 75mM NaHCO3+ 1mM CaCl₂
4. 75mM NaHCO3+Ca²⁺螯合剂（根施：0.4mM，叶面喷施：0.04mM）

1. 重复数：8
2. 检测指标：Na+、Ca2+、K+

具体方案

75mM NaHCO3、75mM NaHCO3+ 1mM CaCl₂、75mM NaHCO3+Ca2+螯合剂处理3d/5d/10d/20d（时间点可调整，20d是原计划时间，电话里说了需要往前调整）后定点检测10 min。

参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/jgVHMzXIJp8mEvsuT6Ny3w

https://mp.weixin.qq.com/s/hoDMtVPbC0jxqVZnvs7kRA

实验2—实时处理

目的：观察NaHCO3的短时处理效应，及外源钙对碱胁迫下离子平衡的影响。

1. 检测样品：油菜
2. 样品品种：碱敏感品种、耐碱品种
3. 检测部位：叶绿体、叶肉细胞
4. 处理方式：

1. CK
2. 75mM NaHCO3
3. 75mM NaHCO3+ 1mM CaCl₂
4. 75mM NaHCO3+Ca²⁺螯合剂（根施：0.4mM，叶面喷施：0.04mM）

1. 重复数：8
2. 检测指标：Na+、Ca2+、K+

具体方案

1. 75mM NaHCO3处理12h/24h/3d（时间点可调整）后，CaCl₂或Ca²⁺螯合剂实时处理。CaCl₂或Ca²⁺螯合剂处理前检测3min，CaCl₂或Ca²⁺螯合剂处理后检测10min。
2. CaCl₂或Ca²⁺螯合剂处理6h/12h/24h/3d（时间点可调整）后，75mM NaHCO3实时处理。75mM NaHCO3处理前检测3min，75mM NaHCO3处理后检测10min。
3. NaHCO3+Ca²⁺螯合剂同时加入会产生沉淀，因此不采用同时处理的方法。

1. 材料：油菜
2. 品种：耐盐、不耐盐
3. 处理：

1. 对照
2. 150mM Na盐处理
3. 150mM Cl盐处理

1. 检测指标：Na+，K+、Cl-
2. 检测部位：根木质部中柱
3. 具体方案：

1. 瞬时实验：

1. 150mM Na盐/Cl盐处理30min后（时间可以调整，但不宜过长），检测10min

1. 预处理实验：150mM Na盐/Cl盐处理12h、72h后，检测10分钟稳定数据（该处理方式下检测木质部需要尝试）

七：重复数：8

1. 材料：感病、抗病
2. 处理：接种白粉菌1d、3d、5d（时间为假设时间，可根据实际情况进行调整）
3. 检测指标：Ca2+
4. 检测位点：叶肉细胞（感病部位）
5. 重复：8
6. 具体实验内容

对接种白粉菌1d、3d、5d后感病、抗病品种的叶肉细胞进行定点检测10min

执行方案 第一阶段

材料：耐盐，不耐盐

处理：对照（正常培养），盐，盐+硝酸铵

检测指标：钠，钾

具体方案：

1.钠外排（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能促进盐胁迫下，棉花根排Na+速率】

材料：对照组（正常培养的2种样品）

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中，平衡20分钟后检测伸长区（+代表有，-代表无），记录3分钟，8重复/组

b.置于+硝酸铵-盐测试液中，平衡20分钟后检测伸长区，记录3分钟，8重复/组

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐（150 mM NaCl）培养液中处理12小时后，移至-硝酸铵-盐测试液中平衡20分钟，检测伸长区，记录5分钟，8重复/组

b.置于+硝酸铵+盐培养液（20 mM NH4NO3，150 mM NaCl）中处理12小时后，移至+硝酸铵-盐测试液中平衡20分钟，检测伸长区，记录5分钟，8重复/组

3）溶液配方

-硝酸铵-盐测试液：0.5 NaCl，pH 6.0

+硝酸铵-盐测试液：20 NH4NO3，0.5 NaCl，pH 6.0

2.钠吸收（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能抑制盐胁迫下，棉花根的吸Na+速率】

材料：对照组（正常培养的2种样品）

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐处理液中处理20分钟后，置于改良-硝酸铵+盐测试液中，2分钟后直接检测，记录5分钟，8重复/组

b.置于+硝酸铵+盐处理液中处理20分钟后，置于改良+硝酸铵+盐测试液中，2分钟后直接检测，记录5分钟，8重复/组

3）溶液配方

-硝酸铵-盐测试液：0.5 NaCl，pH 6.0

+硝酸铵-盐测试液：20 NH4NO3，0.5 NaCl，pH 6.0

改良-硝酸铵+盐测试液：75 mM NaCl，pH 6.0（7.5/75 mM NaCl，pH 6.0作为高低校正液，斜率符合要求即可）

改良+硝酸铵+盐测试液：20 NH4NO3，75 mM NaCl，pH 6.0（20 NH4NO3，7.5/75 mM NaCl，pH 6.0作为高低校正液，斜率符合要求即可）

-硝酸铵+盐处理液：150 mM NaCl，pH 6.0

+硝酸铵+盐处理液：20 NH4NO3，150 mM NaCl，pH 6.0

初步设计

材料：耐盐，不耐盐

处理：对照，盐，盐+硝酸铵

检测指标：钠，钾

具体方案：

1.钠外排（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能促进盐胁迫下，棉花根排Na+速率】

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐测试液中处理2/6/12小时后，移至-硝酸铵-盐测试液中放置20分钟后检测

b.置于+硝酸铵+盐测试液中处理2/6/12小时后，移至+硝酸铵-盐测试液中放置20分钟后检测

2.钠吸收（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能抑制盐胁迫下，棉花根的吸Na+速率】

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测（+代表有，-代表无）

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐测试液中处理20/40/60分钟后，直接检测

b.置于+硝酸铵+盐测试液中处理20/40/60分钟后，直接检测

3.钾外排（测K+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能抑制盐胁迫下，棉花根排K+速率】

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐测试液中处理0.25/2/6小时后，直接检测

b.置于+硝酸铵+盐测试液中处理0.25/2/6小时后，直接检测

1. 材料：样品A、样品B、样品C
2. 处理方式：盐胁迫12h（互为对照）
3. 检测位点：定点检测，根分生区
4. 重复数：8

具体方案

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理12h后（时间点可以调整），移至测试液中放置20分钟后检测，记录5分钟，8重复/组
3. K+外排/吸收（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理12h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

1. 材料：小麦
2. 处理：250mM NaCl处理6/12/24/48h后（时间点可以调整）
3. 检测指标：Na+，K+
4. 检测部位：根分生区
5. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测（即250mM NaCl瞬时处理，处理前检测5min，250mM NaCl处理后检测10min）

b.置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

1. 检测样品：小麦、玉米、水稻
2.  检测部位：根伸长区
3. 检测指标：Cd2+
4. 处理

1. CdCl2（对照）处理24h
2. DNP+CdCl2处理24h
3. TEA+CdCl2处理24h
4. Ca2+抑制剂1+CdCl2处理24h
5. Ca2+抑制剂2+CdCl2处理24h
6. H+抑制剂+CdCl2处理24h

5. 具体实施方案：

定点检测5分钟

6.　 重复数：8

【方案一：预处理（长时处理）】

1. 材料：铜绿微囊藻
2. 处理：

1. 橙光+10mg/L KNO3
2. 橙光+10mg/L NH4Cl
3. 红光+10mg/L KNO3
4. 红光+10mg/L NH4Cl
5. 白光+10mg/L KNO3
6. 白光+10mg/L NH4Cl
7. 绿光+10mg/L KNO3
8. 绿光+10mg/L NH4Cl
9. 蓝光+10mg/L KNO3
10. 蓝光+10mg/L NH4Cl

1. 检测指标：NH4+、NO3-
2. 检测位点：藻细胞表面
3. 重复：6
4. 具体实验内容

橙光、红光处理约2h/6h/12h/24h/3d/7d/14d后的样品，定点检测10min

============================

该实验方案设置的时间点较多，一个是可以看出大概处理多久样品的铵硝吸收差异、变化最大（也可以看出样品短时和长时铵硝吸收效应）；另一个是因为NMT检测的是过程量， 发生在结果量之前，建议老师把处理时间往前提。

【方案二：实时处理】

1. 材料：铜绿微囊藻
2. 处理：

1. 10mg/L KNO3
2. 10mg/L NH4Cl

1. 检测指标：NH4+、NO3-
2. 检测位点：藻细胞表面
3. 重复：6
4. 具体实验内容

2500lux的橙光、红光处理前检测3min，2500lux的橙光、红光处理后的样品，定点检测10min

==================

该方案是想看实时处理下，样品的铵硝吸收情况，表现的是短时吸收效应，仅供参考。

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

1. 无处理
2. 10 mg/mL chitin、病原菌处理24h
3. 10 mg/mL chitin、病原菌瞬时处理

六、具体方案：

处理1、2：无处理、10 mg/mL chitin处理24h、病原菌处理24h后，定点检测叶肉细胞10min，8重复/组

处理3：10 mg/mL chitin、病原菌处理前检测5min，10 mg/mL chitin、病原菌处理后，检测10分钟，8重复/组

【方案一：扫点检测】

1. 检测样品：水稻
2. 检测部位：距根尖300、800、1500、2500、7500、15000μm
3. 检测指标：NH4+、NO3-、K+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20nM量子点处理3d

5. 具体实施方案：

对照、20nM量子点处理3d后，进行扫点检测，每个点检测3min

6. 重复数：8

【方案二：定点检测】

1. 检测样品：水稻
2. 检测部位：根成熟区
3. 检测指标：NH4+、NO3-、K+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20nM量子点处理3d

5. 具体实施方案：

 对照、20nM量子点处理3d后定点检测10min

6. 重复数：8

【方案三】

1. 检测样品：水稻
2. 检测部位：扫点+定点
3. 检测指标：NH4+、NO3-、K+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20nM量子点处理3d

5. 具体实施方案：

1）使用对照进行扫点检测距根尖300、800、1500、2500、7500、15000μm这6个位点，4重复

2）根据扫点结果，确定最大吸收位点，进行定点检测，8重复/组

【方案一：预处理（长时处理）】

目的：观察Cd长时处理效应

1. 材料：水稻
2. 处理：

1. 无AMF益生菌
2. 无AMF益生菌+ 5ppm CdCl2
3. 有AMF益生菌
4. 有AMF益生菌+ 5ppm CdCl2

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：根成熟区（Cd2+在成熟区变化较明显）
3. 重复：8
4. 具体实验内容

5ppm CdCl2种植5个月后，定点检测水稻根成熟区5min

【方案二：实时处理】

目的：Cd实时处理后，Cd2+的吸收信号相对较强，有利益观察不用处理间的差异

1. 材料：水稻
2. 处理：

1. 无AMF益生菌，5ppm CdCl2 实时处理
2. 有AMF益生菌，5ppm CdCl2实时处理

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：根成熟区（Cd2+在成熟区变化较明显）
3. 重复：8
4. 具体实验内容

5ppm CdCl2处理前检测5min，5ppm CdCl2处理后检测10min

【方案一】

目的：观察整条根的K+泄露情况

1. 检测样品：水稻
2. 基因型：突变体、WT
3.  检测部位：根分生区、伸长区、成熟区
4. 检测指标：K+
5. 具体实施方案：
   检测距根尖500（分生区）、1500（伸长区）、7500（成熟区）μm这3个位点，每个点检测5分钟
6. 重复数：8

【方案二】

1. 检测样品：水稻
2. 基因型：突变体、WT
3. 检测部位：根分生区
4. 检测指标：K+
5. 具体实施方案：
   定点检测5分钟
6. 重复数：8

一、材料：水稻（WT、OE、RNAi）

二、检测指标：Ca2+

三、检测位点：根分生区过渡区

四、处理：

a.对照

b.0.4mM ZnSO4

c.4mM ZnSO4

五、具体实验细节：

0.4/4mM ZnSO4处理前检测5min，0.4/4mM ZnSO4实时处理后处理后检测10min

六、重复数：8

一、材料：芍药

二、处理：对照、三种真菌侵染根部

三、检测指标：Na+，K+

四、检测部位：根

五、具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）真菌侵染组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）真菌侵染组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），移至测试液中放置20分钟后检测，记录5分钟，8重复/组
3. K+外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）真菌侵染组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

【方案一】

目的：观察纳米颗粒的长时处理效应

1. 材料：青鳉
2. 检测部位：鳃
3. 检测指标：Na+、Cl-、NH4+、H+（pH）
4. 处理：
   3种不同尺寸的纳米颗粒处理1d、3d、5d、7d
5. 具体方案：

定点检测5分钟，8重复/组

【方案二】

目的：纳米颗粒实时处理后信号变化相对较强，有利于观察不用处理间的差异

1. 材料：青鳉
2. 检测部位：鳃
3. 检测指标：Na+、Cl-、NH4+、H+（pH）
4. 处理：
   3种不同尺寸的纳米颗粒实时处理
5. 具体方案：

加入纳米颗粒前检测5分钟，加入纳米颗粒后检测10分钟

一、材料：葡萄

二、检测指标：NH4+、NO3-

三、检测位点：根成熟区、茎、叶肉细胞

【实验目的】在正常的土壤中加入尿素会导致铵态氮会转化成硝态氮，但是植物吸收不了这么多硝态氮就会流失，加入DMPP可以抑制铵态氮向硝态氮转化。这个实验就是探究加入DMPP后铵态氮、硝态氮的利用分配，植株各部位吸收的铵态氮和硝态氮有无增加，对生产中果实产量和品质的影响。

四、重复：6

五、处理

1. 对照
2. 0.1%DMPP
3. 0.2%DMPP
4. 0.3%DMPP

在施肥前1天和施肥后3天检测

【方案一】实时处理

目的：根据经验，实时处理后，NH4+、NO3-的信号变化相对较强，有利于观察不用处理间的差异。

具体内容：DMPP处理前样品检测3min，0.1%、0.2%、0.3%DMPP实时加药处理后，定点检测10min。

【方案二】预处理处理

目的：观察NH4+、NO3-吸收的长时效应

具体内容：0.1%、0.2%、0.3%DMPP处理前1天的样品定点检测5min，0.1%、0.2%、0.3%DMPP处理后3天的样品定点检测5min。

【方案一：预处理（长时处理）】

1. 材料：葡萄
2. 处理：

1. CK
2. 200mM NaCl +0.2mM硫酸铵处理2、4、6d
3. 200mM NaCl +2mM硫酸铵处理2、4、6d

1. 检测指标：Na+、H+、IAA、NO3-、NH4+
2. 检测部位：根分生区过渡区（Na+、H+、IAA）、成熟区（NO3-、NH4+）
3. 具体方案： 

1. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）处理组
   复合溶液处理2、4、6d后，定点检测10分钟，8重复/组
2. H⁺、IAA 、NO3-、NH4+

复合溶液处理2、4、6d后，定点检测10分钟，8重复/组

【方案二：瞬时处理】

1. 材料：葡萄
2. 处理：

1. CK
2. 200mM NaCl +0.2mM硫酸铵处理2、4、6d
3. 200mM NaCl +2mM硫酸铵处理2、4、6d

1. 检测指标：Na+、H+、IAA、NO3-、NH4+
2. 检测部位：根分生区过渡区（Na+、H+、IAA）、成熟区（NO3-、NH4+）
3. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）

【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】

一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

1. 0.2、2mM硫酸铵处理2、4、6d后，200mM NaCl处理0.5h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组

2. H⁺、IAA、NO3-、NH4+

0.2mM、2mM硫酸铵处理2、4、6d后，200mM NaCl瞬时处理前检测3min，200mM NaCl瞬时处理后检测10min

1. 材料：拟南芥
2. 处理：

1. 纯化真菌滤液1
2. 纯化真菌滤液2
3. 纯化真菌滤液3

1. 检测指标：H+
2. 检测部位：根分生区（过渡区中点）
3. 具体方案：

1. 纯化真菌滤液1、2、3处理拟南芥根24h后（处理时间可调整），定点检测10分钟
2. 纯化真菌滤液1、2、3处理前检测5分钟，纯化真菌滤液1、2、3实时处理后检测10分钟

七、重复数：8

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：WT、OE1、OE2、RNAi
3. 检测部位：根分生区（过渡区中点）
4. 检测指标：Ca2+、Na+、K+、Cl-
5. 处理：

1. 150mM NaCl
2. 145mM NaCl+5mM Na2CO3
3. 10%PEG6000

1. 具体方案：

1. Ca2+预处理
   150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG处理6h后（处理时间可调整），定点检测10分钟在，8重复/组
2. Ca2+实时处理
   150mM NaCl、145mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG处理前检测5分钟，150mM NaCl、145mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG处理10min后检测15-20分钟（经费允许可以持续检测30分钟），8重复/组
3. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐碱材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   a.置于150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3中处理0.5/1/2h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
4. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐碱材料的耐受机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   置于150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
5. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐碱胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐碱胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐碱材料，胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）胁迫组

1. 150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG胁迫后，立即检测

b.置于150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

6. Cl-方案参考Na+

实验1—Ca2+、H+、K+流速

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：根部伸长区—老师写的是成熟区（距离根冠1000 μm以上）
3. 检测样品品种：WT、HA12#17、HA12#58、HA16#3、HA16#4、HA24#13、HA24#14
4. 处理方式：无处理（对照）、7 mM 的NaHCO3处理24 h-48h（时间点不确定，暂定24和48h）
5. 重复数：8
6. 检测指标：Na+、H+、K+

具体方案

对照组、7mM NaHCO3胁迫24h、48h后定点检测5 min

目的：观察NaHCO3长时处理效应，比较植物耐碱胁迫的能力

参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/jgVHMzXIJp8mEvsuT6Ny3w

https://mp.weixin.qq.com/s/hoDMtVPbC0jxqVZnvs7kRA

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：WT、突变体
3. 检测部位：保卫细胞
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理：10μM ABA实时处理
6. 具体方案：

WT：10μM ABA处理前检测5min，10μM ABA处理后检测20min（3个重复，用于确定信号变化比较大的时间段）

10μM ABA处理前检测5min，10μM ABA处理后检测10min（5个重复，假如根据上面的三个重复确定数据在加药后10min可以稳定，则之后的样品都检测10min）

突变体：10μM ABA处理前检测5min，10μM ABA处理后检测10min（8重复）

一、材料：玫瑰

二、处理：对照、3%NaCl、5%NaCl

三、检测指标：Na+，K+

四、检测部位：根分生区

五、具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），移至测试液中放置20分钟后检测，记录5分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

1. 检测样品：马铃薯
2. 基因型：高积累、低积累
3. 检测部位：根伸长区、茎维管束
4. 处理：50μM CdCl2处理6h、48h
5. 检测指标：Ca2+、Cd2+、H+
6. 具体实施方案：

50μM CdCl2处理6h、48h后，定点检测10分钟，8重复/组

1. 材料：蓝藻
2. 检测指标：NO3-
3. 检测位点：蓝藻细胞定点检测
4. 实验目的：蓝藻在化感物质（黄酮）的胁迫下，硝酸盐的吸收是否受到影响

具体方案

1）实时处理

目的：黄酮实时处理后，NO3-的信号变化相对较强，有利益观察不用处理间的差异

1. 0.1mM黄酮实时处理

方案：瞬时处理前检测3min，瞬时处理后检测10分钟，现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。

2）预处理

目的：观察NO3-长时处理效应

1. 对照，0.1mM黄酮、0.5mM黄酮处理24h
2. 对照，0.1mM黄酮处理6h、24h

方案：处理后检测3min（a、b处理方式均适用）。

六、参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/VSGIRPkre9xckMPdidEwjg

【方案一：NaCl浓度递增处理】

1. 材料：花花柴
2. 处理：
   0、100、200、300、400mM NaCl以递增的方式添加，直到添加到400mM NaCl后，再处理24h。
3. 检测指标：Na+，K+
4. 检测部位：根分生区
5. 具体方案：

1. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理24h后，记录10分钟，8重复/组
2. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测（即100、200、300、400mM NaCl瞬时处理，处理前检测5min，NaCl处理后检测10min）

b.置于盐溶液中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组

【方案二：NaCl直接处理，可能植物有应激反应，但是不会影响离子流速的变化】

1. 材料：花花柴
2. 处理：
   0、100、200、300、400mM NaCl处理6/12/24/48h后（时间点可以调整）
3. 检测指标：Na+，K+
4. 检测部位：根分生区
5. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录0分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测（即100、200、300、400mM NaCl瞬时处理，处理前检测5min，NaCl处理后检测10min）

b.置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

1. 材料：枸杞、番茄
2. 基因型：WT、转基因
3. 处理：100mM NaCl（浓度可调整）
4. 检测指标：Na+，K+
5. 检测部位：根分生区、叶肉细胞
6. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录5分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

一、材料：WT、OE、RNAi

二、处理：

1）20 μmM CdCl2瞬时处理（可测根成熟区、根中柱、茎木质部）

目的：Cd实时处理后，Cd2+吸收和H2O2的信号相对较强，有利益观察不用材料间的差异

2）20 μmM CdCl2处理5d（可测根成熟区）

目的：观察Cd长时处理效应

三、检测指标：Cd2+

四、检测位点：根成熟区、根中柱、茎木质部

五、具体实验细节：

1、Cd2+

1）瞬时实验：20 μmM CdCl2处理前检测5min，20 μmM CdCl2实时处理后处理后检测10min

2）预处理实验：20 μmM CdCl2处理5d后，检测10分钟稳定数据即可

六、重复数：8

七、参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/ghdDSYJqyha59A5_BYFCJg

一、材料：柑橘砧木、枳

二、检测指标：H+

三、检测位点：根成熟区

四、重复：8

五、处理

1）低B（10μM硼，0μM铝）

2）低B+Al（10μM硼，300μM铝） 

3）高B（50μM硼，0μM铝）

4）高B+Al（50μM硼，300μM铝）

六、具体方案

实验1：检测排H+速率（Al预处理3h）

目的：观察硼缓解铝毒的长时处理效应

a）低B/高B处理2d（时长可调整），检测5min数据

b）低B/高B处理2d（时长可调整），加入Al处理3h（时长可调整）后，检测5min数据

c）备注：上述方案是B预处理后Al处理（参考PP文章），如有需要，也可以选择B和Al同时处理的方式。

实验2：检测根表H+浓度/pH值（Al预处理3h）

目的：观察B处理后，Al胁迫下根表pH值的变化（NMT可以测根表pH）

具体方案：与实验1一致

实验3：检测Al实时处理后的排H+速率

目的：根据经验，Al实时处理后，H+的信号变化相对较强，有利于观察不用处理间的差异

a）低B/高B处理2d（时长可调整），检测5min数据（如果做了实验1，这个可以不做），实时加入300μM铝试剂，立即持续检测10min数据。

b）实时加入铝试剂后的检测时长，暂定10min，现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如10min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到10min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。

七、参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/Rfl3Cmhf4HmhI7WNA-v6Mg

一、材料：斑马鱼

二、检测指标：H+

三、检测位点：斑马鱼胚胎

四、处理：

a.对照（pH7.0）

b.酸处理（pH5.0）3-4天

c.碱处理（pH8.0/9.0）3-4天

五、具体实验细节：

处理3-4天，出现卵黄囊时开始检测，定点检测10min。

六、重复数：8

测试液：

对照：0.5mM NaCl，0.16mM KH2PO4，0.16mM K2HPO4，0.2mM MgSO4，0.2mM CaSO4，pH7.0

酸处理：0.5mM NaCl，0.16mM KH2PO4，0.16mM K2HPO4，0.2mM MgSO4，0.2mM CaSO4，pH5.0

碱处理：0.5mM NaCl，0.16mM KH2PO4，0.16mM K2HPO4，0.2mM MgSO4，0.2mM CaSO4，10mM NaHCO3，pH8.0/9.0

实验一

1. 材料：大白菜
2. 基因型/品种：自交系A03
3. 检测部位：根分生区（H+）、根成熟区（Cd2+）
4. 检测指标：H+（流速、根表pH）、Cd2+（流速）
5. 处理：

1. CK
2. 200mM NaCl处理 2d

1. 具体方案：

1. H+、Cd2+

200mM NaCl处理2d后，定点检测10分钟在，8重复/组

实验二：离子浓度成像检测

一、材料：大白菜

二、基因型/品种：自交系A03

三、检测部位：根分生区

四、检测指标：H+

五、处理：

1. CK
2. 200mM NaCl处理 2d

1. 材料：大白菜
2. 基因型：自交系A03
3. 检测部位：根分生区（过渡区中点）
4. 检测指标：Ca2+、Na+、K+、Cl-
5. 处理：

1. CK

200mM NaCl处理 2d

1. 具体方案：

1. Ca2+预处理
   200mM NaCl处理6h后（处理时间可调整，因为Ca2+变化较快，所以盐处理时间比较短，处理2天时间较长可能信号变化不明显），定点检测10分钟，8重复/组
2. Ca2+实时处理
   200mM NaCl处理前检测5分钟，200mM NaCl处理10分钟后检测15-20分钟（经费允许可以持续检测30分钟），8重复/组
3. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐碱材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   a.置于200mM NaCl中处理0.5/1/2h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
4. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐碱材料的耐受机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   置于200mM NaCl中处理2d后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
5. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐碱胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐碱胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐碱材料，胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）胁迫组

1. 200mM NaCl胁迫后，立即检测

b.置于200mM NaCl中处理48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

6. Cl-方案参考Na+

一、材料：玉米

二、品种/基因型：突变体

三、检测指标：Ca2+

四、检测位点：玉米雌穗幼穗

五、具体实验细节：

突变体穗上正常的小花原基、突变的小花原基（在同一雌穗上）定点各自检测10min

六、重复：8

1. 材料：两个油菜品种
2. 检测指标：Ca²⁺
3. 检测部位：根尖分生区（分生区Ca²⁺信号最明显）
4. 处理：对照、实时0℃低温处理

1. 对照：油菜正常状态下的Ca²⁺信号变化
2. 实时0℃低温处理：检测完正常状态下的Ca²⁺信号变化后，实时把检测环境变成0℃，检测时间不少于15分钟（根据实验的实际情况决定检测时长，以实际检测到的稳定Ca²⁺信号时间为准）

材料：烟草

基因型/品种：PBI121-GFP、PBI121-2.1GFP、PBI121-2.2GFP

检测位点：根分生区

【实验目的】前期的实验是看到了基因可以增强植物的抗逆性，现在想用NMT再验证一下

方案一：预处理—利于观察离子转运的长时效应

【盐胁迫—预处理】

1. 检测指标：Na+、K+
2. Na+吸收（测Na+）
   目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少。一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录3分钟，6重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于250mM盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组
3. Na+外排（测Na+）
   目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异。这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录3分钟，6重复/组
   2）盐胁迫组
   置于250mM盐溶液中处理12h后检测，记录3分钟，6重复/组
4. K+外排/吸收（测K+）

目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少。一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，6重复/组

2）盐胁迫组

置于盐溶液中处理12h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组

【干旱胁迫—预处理】

1. 检测指标：Ca2+、H+
2. 具体方法：10% PEG处理12h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组

【低温胁迫—预处理】

1. 检测指标：Ca2+
2. 具体方法：4℃低温处理12h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组

方案二：瞬时处理—根据经验，实时处理后，离子转运信号变化相对较强，利于观察不用处理间的差异。

【盐胁迫—瞬时处理】

1. 检测指标：Na+、K+
2. 具体方法

1. Na+
   250mM NaCl处理前定点检测3min，250mM NaCl处理前处理后定点检测10min，6重复/组
2. K+

250mM NaCl处理前定点检测3min，250mM NaCl处理前处理后定点检测10min，6重复/组

【干旱胁迫—瞬时处理】

1. 检测指标：Ca2+、H+
2. 具体方法：10% PEG处理前定点检测3min，10% PEG处理后定点检测10min，6重复/组

【低温胁迫—瞬时处理】

1. 检测指标：Ca2+
2. 具体方法：4℃低温处理前定点检测3min，4℃低温处理后定点检测10min，6重复/组

方案三

1. 材料：烟草
2. 基因型/品种：PBI121-GFP、PBI121-2.1GFP、PBI121-2.2GFP

三、检测位点：根分生区（过渡区中点）

【实验目的】前期的实验是看到了基因可以增强植物的抗逆性，现在想用NMT再验证一下

【盐胁迫—预处理】

1. 检测指标：Na+、K+
2. 具体方法：150mM NaCl处理24h后，定点检测5min，8重复/组

【干旱胁迫—实时处理】

1. 检测指标：Ca2+、K+
2. 具体方法：

1. Ca2+实时处理：15% PEG处理前检测5分钟，15% PEG处理检测10min，8重复/组
2. K+预处理：15% PEG处理5h后，定点检测5min，8重复/组

【低温胁迫—实时处理】

1. 检测指标：Ca2+、K+
2. 具体方法：

1. Ca2+实时处理：4℃低温处理前检测5分钟，4℃低温处理后检测10min，8重复/组
2. K+预处理：4℃低温处理5h后，定点检测5min，8重复/组

测试液：

1. 盐胁迫测Na+：1mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH6.0
   盐胁迫测K+：150mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.1mM KCl，pH6.0
2. 干旱胁迫测Ca2+、K+
   瞬时加药前：0.5mM CaCl2，0.5mM KCl，pH6.0
   瞬时加药后/预处理：15% PEG，0.5mM CaCl2，0.5mM KCl，pH6.0
3. 低温胁迫测Ca2+、K+：0.1mM CaCl2，0.1mM KCl，pH6.0

材料：烤烟

基因型/品种：1个对照、2个过表达株系、2个RNAi株系

检测指标：NH4+、NO3-

检测位点：根

【实验目的】分析不同氨基酸转运蛋白NtTAT（WT、OE、RNAi）NO3-和NH4+在膜上外排和内流的速率，检测氨基酸转运蛋白NtTAT是否直接影响了NO3-和NH4+氮素。

（这是第一步实验，目的是想看烟草对铵硝的偏好性，老师预期是对硝偏好性大一些）

重复：6

【具体方案】

1. 扫点实验：对照样品选取4个重复进行扫点实验，具体检测位点
   1. NH4+：300μm（分生区）、800μm（分生区/伸长区）、1500μm（伸长区/成熟区）、7500μm（成熟区），每个点检测3min
   2. NO3-：800μm（分生区/伸长区）、1500μm（伸长区/成熟区）、2500μm（伸长区）、5000μm（成熟区）、7500μm（成熟区），每个点检测3min
2. 定点实验：根据扫点实验结果，选择NH4+、NO3-吸收/差异最大的点进行定点实验，每个点检测5min

1. 材料：烤烟
2. 基因型/品种：1个对照、2个过表达株系、2个RNAi株系

三、检测指标：NO3-

四、检测位点：根

【实验目的2】检测WT、OE、RNAi在不同浓度NO3-（0、0.1%、0.3%）下处理下氨基酸转运蛋白NtTAT（WT、OE、RNAi）中NO3-流速，探讨过表达氨基酸转运蛋白NtTAT材料是否耐更高浓度氮素

四、重复：8

【具体方案】

1. 不同浓度NO3-处理3天后（时间点可根据实际情况调整），定点检测5min

1. 材料：烤烟
2. 基因型/品种：1个对照、2个过表达株系、2个RNAi株系

三、检测指标：NO3-

四、检测位点：根

【实验目的3】分析氨基酸转运蛋白NtTAT（WT、OE、RNAi）利用不同浓度（假设两个浓度：高、低）的能量阻断剂处理下在合适的NO3­浓度下（0、0.1%）氨基酸转运蛋白NtTAT是否存在依靠能量转运。

四、重复：8

【具体方案】

1. 高、低浓度的能量阻断剂处理3天后（时间点可根据实际情况调整），定点检测5min

一、材料：水稻

二、处理：

1）瞬时处理

目的：Cd实时处理后，Cd2+吸收信号相对较强，有利益观察不同材料、不同处理间的差异

1. CK（20μM CdCl2）
2. CK+5%DCD
3. CK+10%DCD
4. CK+0.5%DMPP
5. CK+1%DMPP

2）预处理7d

目的：观察Cd长时处理效应

1. CK（20μM CdCl2）
2. CK+5%DCD
3. CK+10%DCD
4. CK+0.5%DMPP
5. CK+1%DMPP

三、检测指标：Cd2+

四、检测位点：根成熟区

五、具体实验细节：

1）瞬时处理前（CK）检测3min，5%DCD、10%DCD、0.5%DMPP、1%DMPP瞬时处理后检测15min，现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。

2）5%DCD、10%DCD、0.5%DMPP、1%DMPP处理7d后，检测5分钟稳定数据即可

1. 检测样品：水稻
2. 检测样品品种：玉珍香、湘晚籼12
3. 检测部位：根
4. 检测指标：Cd²⁺、O₂
5. 处理方式：

1. 30 μM CdCl₂+无铁膜（处理3h）
2. 30 μM CdCl₂+有铁膜（处理3h）
3. 5 mM 硅酸钠+30 μM CdCl₂+无铁膜（处理3h）
4. 5 mM 硅酸钠+30 μM CdCl₂+有铁膜（处理3h）

【实验一：扫点检测】

目的：确定Cd2+最大吸收位点

1. 检测位点：水稻根冠顶端、分生区、伸长区、成熟区
2. 测定时间：5min
3. 检测指标：Cd2+
4. 重复数：4

具体内容：检测“30 μM CdCl₂+无铁膜”处理组的样品即可确定后续定点检测的位点。

【实验二：定点检测】

目的：探究铁膜是如何影响镉胁迫下Cd2+转运的。

1. 检测位点：根据扫点结果确定/确定区域中有铁膜的位点和无铁膜的位点
2. 测定时间：5min
3. 检测指标：Cd2+
4. 重复数：8

具体内容： 30μM CdCl2+无铁膜（该处理检测4个重复，其余处理检测8个重复）、30μM CdCl2+有铁膜、5mM 硅酸钠+30μM CdCl2+无铁膜、 5mM 硅酸钠+30 μM CdCl2+有铁膜定点检测5min。

备注：该组实验可以检测同一条根上有铁膜的和没有铁膜的位点，探究在同一条根上，铁膜影响Cd2+吸收的机制。

【实验三：定点检测】

目的：探究O2在铁膜缓解镉胁迫中的作用。

1. 检测位点：根据Cd2+扫点结果确定
2. 测定时间：5min
3. 检测指标：O2
4. 重复数：8

具体内容：30μM CdCl2+无铁膜、30μM CdCl2+有铁膜、5mM 硅酸钠+30μM CdCl2+无铁膜、5mM 硅酸钠+30 μM CdCl2+有铁膜定点检测5min。

【实验四：定点检测】

目的：探究木质部Cd2+的装载能力

1. 检测位点：根木质部
2. 处理：

1. 有/无硅酸钠预处理，Cd实时处理
2. 同时实时处理

1. 测定时间：5min
2. 检测指标：Cd2+
3. 重复数：8

具体内容：Cd/Cd+硅酸钠处理前检测5min，Cd/Cd+硅酸钠处理后检测10min。

1. 材料：山定子砧木
2. 基因型：WT1、WT2、WT3、WT4、OE1、OE2、OE3、OE4
3. 检测部位：根分生区
4. 检测指标：H+
5. 具体方案：

定点检测5min，8重复/组

1. 材料：转基因苹果砧木
2. 检测部位：根成熟区（约距根尖3000μm）
3. 检测指标：NO3-
4. 处理：

1. 低氮（0.3 mM NO3-）处理24 h
2. 低氮24 h +原钒酸钠处理40 min

1. 具体方案：

定点检测5min，4重复/组（根据现场结果可能会增加至8个重复）

一、材料：苹果果实

二、检测部位：病斑处、非病斑处（检测靠近果肉的那一侧）

三、检测指标：Ca2+、Mg2+、K+

四、处理：

1. 正常健康的苹果
2. 发病的病斑中心
3. 病斑边缘1-2mm处
4. 同一个发病的果子上，远离病斑处

五、具体方案：

1. 、2)均选择的靠近花萼一端，定点检测5min，8重复/组

1. 材料：苹果
2. 基因型：EV、iqm
3. 检测部位：根成熟区
4. 检测指标：H+
5. 处理：缺铁处理
6. 具体方案：

定点检测5 min，3重复/组

1. 材料：苹果
2. 检测部位：根分生区
3. 检测指标：H2O2
4. 处理：

1. 40μM FeEDTANa处理0h 3h 6h 9h 12h 1d 3d 6d 9d
2. 0μM FeEDTANa处理0h 3h 6h 9h 12h 1d 3d 6d 9d

1. 具体方案：

0/40μM FeEDTANa处理0h 3h 6h 9h 12h 1d 3d 6d 9d后，定点检测10min，8重复/组

【方案一】

1. 材料：苹果
2. 处理：

1. 0.4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O
2. 0.4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
3. 4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
4. 4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
5. 16 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
6. 16 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养

1. 检测指标：Cu2+
2. 重复：8
3. 检测位点：距根尖400μm
4. 实验方案：

处理20d后的样品，定点检测5分钟稳定数据

【方案二】

1. 材料：苹果
2. 处理：

1. 0.4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O
2. 0.4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
3. 4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
4. 4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
5. 16 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
6. 16 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养

1. 检测指标：Cu2+
2. 重复：8
3. 检测位点：距根尖400μm
4. 实验方案：

处理1d、5d后（时间可以调整）的样品，定点检测5分钟稳定数据

【方案三】

1. 材料：苹果
2. 处理：

1. 0.4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O
2. 0.4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
3. 4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
4. 4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
5. 16 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
6. 16 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养

1. 检测指标：Cu2+
2. 重复：8
3. 检测位点：距根尖400μm
4. 实验方案

处理前检测3min，加药后（具体就是上述1-6种处理）检测10min。

目的：实时处理后，CU2+的吸收信号相对较强，有利益观察不用处理间的差异

【原因】因为您是通过处理20天的样品上看到了表型的差异或者是Cu含量的差异，但是因为这个变化是一个结果量，是积累了一段时间的变化，但是因为NMT检测的是一个过程量，它是发生在结果量之前的，处理20天可能对照组和处理组之间的差异已经比较小了，所以建议可以把处理时间提前一些，目前老师一般都是测得处理时间比较短

方案一

1. 材料：拟南芥
2. 品种：WT、atdfb-3
3. 处理：

1. 9.4mM KNO3处理1d、3d、6d
2. 9.4mM KNO3 +叶酸处理1d、3d、6d（仅处理atdfb-3突变体）

1. 检测指标：NO₃^-
2. 检测部位：根成熟区
3. 具体方案：

处理1d、3d、6d后，检测10分钟稳定数据

七、重复数：6

方案二

1. 材料：拟南芥
2. 品种：WT、atdfb-3
3. 处理：

1. 9.4mM KNO3处理6d
2. 9.4mM KNO3 +叶酸实时处理（仅处理atdfb-3突变体）

1. 检测指标：NO₃^-
2. 检测部位：根成熟区
3. 具体方案：

1. 9.4mM KNO3处理6d后，检测10分钟稳定数据，8重复/组
2. 9.4mM KNO3 +叶酸实时处理前检测5分钟，9.4mM KNO3 +叶酸实时处理后持续检测20分钟（摸索最佳处理时间），4重复/组

测试液

9.4mM KNO3，0.1mM CaCl2，pH6.0

叶酸，9.4mM KNO3，0.1mM CaCl2，pH6.0

2021.9.9

1. 材料：拟南芥
2. 品种：WT、atdfb-3
3. 处理：

1. 9.4mM KNO3处理6d
2. 9.4mM KNO3+50μM叶酸处理6d

1. 检测指标：NO₃^-
2. 检测部位：根成熟区
3. 具体方案：

处理6d后，检测10分钟稳定数据

七、重复数：6

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：转基因1、转基因2、转基因3、转基因4、突变体1
3. 重复数：6

二、处理：

NaCl处理24h

三、检测指标：Na+

四、检测位点：根分生区（过渡区）

五、具体实验细节：

NaCl处理24h后，定点检测5分钟稳定数据

【目的：查看盐胁迫下，不同植物根部排Na+能力差异】

周四早上：

先进行周五早上盐胁迫苗子的处理（需要NaCl胁迫24小时）

周五：

上午对前一天NaCl处理的苗子进行测试

实验1、基因A对盐胁迫介导的跨膜离子流动的影响，共12个样品

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：根
3. 检测样品品种：A和B（*2）
4. 检测指标：Na⁺外排
5. 处理方式：正常培养5~6天后，100mM NaCl处理24h后，放入测试液。
6. 检测位点：扫点：根毛区、分生区、伸长区（*3），优先测根毛区。
7. 测定时间：对照组：检测3分钟（三个区域测同一棵苗，进行扫点）
   盐胁迫组：测5分钟（三个区域测同一棵苗，进行扫点）
8. 重复数：3（*3）
9. 处理液：NaCl（100mM），pH5.8
   测试液：NaCl（0.5mM），pH5.8

实验2、基因A对冷胁迫介导的跨膜离子流动的影响，共12个样品

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：根
3. 检测样品品种：A和B（*2）
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：正常培养后冷胁迫瞬时处理
6. 检测位点：分生区、伸长区（*2），优先测分生区。
7. 测定时间：处理前：检测3分钟
   4℃处理瞬时处理后：检测10分钟
   （处理前处理后测同一棵苗）
8. 重复数：3（*3）
9. 测试液：0.5 mM CaCl_2，pH5.8
   低温测试液：0.5 mM CaCl₂，pH5.8

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：WT、转基因1、转基因2
3. 处理：200mM NaCl处理24h
4. 检测指标：Na+，K+
5. 检测部位：根分生区（过渡区中间）
6. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于200mM NaCl中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于200mM NaCl中处理24h后，记录10分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

1. 200mM NaCl胁迫后，立即检测（200mM NaCl实时处理）

b.置于200mM NaCl中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组（200mM NaCl预处理24h）

【实验一：实时处理】

1. 材料：6日龄拟南芥
2. 基因型：WT、突变体

三、检测指标：Ca²⁺

四、检测位点：根分生区（过渡区）

五、重复：8

【具体方案】

1. 对照组：5 mg/L DMSO 处理前检测5min，5 mg/L DMSO实时处理后检测10 min
2. 处理组：5 mg/L TM处理前检测5min，5 mg/L TM实时处理后检测10 min

备注：对照组、处理组能否只检测一组药品处理前的样品

【实验二：预处理】

1. 材料：6日龄拟南芥
2. 基因型：WT、突变体

三、检测指标：Ca²⁺

四、检测位点：根分生区（过渡区）

五、重复：8

【具体方案】

TM处理0h（对照）、3h、6h后定点检测5min

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：保卫细胞
3. 检测样品品种：WT
4. 检测指标： K⁺、Cl-
5. 处理方式：

1. flg22（100 nM）实时处理
2. ABA（10 uM）实时处理
3. flg22+SCREW实时处理
4. ABA+SCREW实时处理

1. 检测位点：保卫细胞定点检测
2. 测定时间：a、b、c、d组加药前检测3min，加药后检测10min（根据前两个样品数据的稳定情况决定后续样品的检测时间）
3. 重复数：6

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：野生型、突变体、过表达
3. 处理：50μM ACC处理10min
4. 检测指标：H2O2
5. 检测位点：保卫细胞
6. 重复：3
7. 具体实验内容

50μM ACC处理前检测10min，50μM ACC处理10min后再检测10min

1. 检测样品：棉花
2. 基因型：WT、转基因1、转基因2
3. 检测部位：棉花纤维顶端、侧边
4. 处理：1DPA、3DPA
5. 检测指标：H+
6. 具体实施方案：

所有材料选择同一位置的胚珠上相同区域的纤维细胞进行检测，检测10分钟，8重复/组

=========

测试液：0.1mM CaCl2，pH6.0

【方案一】

1. 材料：梨果实
2. 检测部位：果皮（在注射孔周围取样，检测靠近果肉的那一侧）
3. 检测指标：Ca²⁺（流速）、H2O2（流速）
4. 处理：

1. 注射空载
2. 转基因1
3. 转基因1+2%CaCl₂浸泡5s
4. 转基因2
5. 转基因2+2%CaCl₂浸泡5s
6. 2%CaCl₂实时处理

1. 具体方案：

1、2、3、4、5组处理定点检测10分钟，8重复/组

6组处理2%CaCl₂实时处理后持续监测15分钟，8重复/组

测试液：0.01mM CaCl2，pH6.0

【方案二】

1. 材料：梨果实
2. 检测部位：果皮（在注射孔周围取样，检测靠近果肉的那一侧）
3. 检测指标：Ca2+（检测果实内部质外体浓度）、H2O2（浓度）
4. 处理：

1. 注射空载
2. 转基因1
3. 转基因1+2%CaCl₂浸泡5s
4. 转基因2
5. 转基因2+2%CaCl₂浸泡5s

1. 具体方案：

定点检测，8重复/组

测试液：0.01mM CaCl2，pH6.0

1. 检测样品：黄瓜
2. 基因型：WT、转基因1、转基因2、转基因3
3.  检测部位：根分生区
4. 处理：4℃低温实时处理
5. 检测指标：Ca2+
6. 具体实施方案：

4℃低温处理前（常温）检测10分钟，4℃低温处理后（低温）检测10分钟，8重复/组

【方案一：实时处理】

1. 材料：番茄
2. 处理：干旱胁迫（10%PEG8000）、几丁质胁迫（浓度未定）
3. 检测指标：Ca2+、H2O2、IAA
4. 检测位点：干旱胁迫（根、叶肉细胞、保卫细胞）、几丁质胁迫（叶肉细胞、保卫细胞）
5. 重复：8
6. 具体实验内容

1. 10%PEG处理前检测3min，10%PEG处理后检测10min
2. 几丁质处理前检测3min，几丁质处理后检测10min

【方案二：预处理（长时处理）】

1. 材料：番茄
2. 处理：干旱胁迫（10%PEG8000）、几丁质胁迫（浓度未定）
3. 检测指标：H2O2、IAA
4. 检测位点：干旱胁迫（根、叶肉细胞、保卫细胞）、几丁质胁迫（叶肉细胞、保卫细胞）
5. 重复：8
6. 具体实验内容

10%PEG、几丁质处理4h/6h/12h/24h（时间不宜过长）后，定点检测5min

实验1—IAA、H₂O₂、H⁺、Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：AC
4. 检测指标：IAA、H₂O₂、H⁺、Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+光照（光照持续伴随样品）
2. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
4. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
5. 27mM CaCl₂处理2h+常温+光照（光照持续伴随样品）
6. 27mM CaCl₂处理2h +常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
7. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
8. 27mM CaCl₂处理2h +4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、b、e、f组定点检测5min
2. c、d、g、h组检测20min（先看前2-3个样品的数据稳定情况再进行时间调整）

1. 重复数：8
2. 测试液
   IAA、H₂O₂、H⁺、Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0
3. 光照强度：30000-35000lux

实验2—Ca²⁺成像检测

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：AC
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+光照（光照持续伴随样品）
2. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
4. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
5. 27mM CaCl₂处理2h+常温+光照（光照持续伴随样品）
6. 27mM CaCl₂处理2h +常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
7. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
8. 27mM CaCl₂处理2h +4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）

1. 采集位点：0、30、60、90、120、150μm
2. 测定时间：低温处理12h（处理时间待确认）
3. 重复数：8
4. 测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0
5. 光照强度：30000-35000lux

实验3—Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：沉默A、沉默B、沉默C、沉默D
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
2. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 27mM CaCl₂处理2h+常温+黑暗
4. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+黑暗

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、c组定点检测5min
2. b、d组检测20min（先看前2-3个样品的数据稳定情况再进行时间调整）

1. 重复数：8
2. 测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

【方案一：扫点+瞬时】

1. 材料：番茄
2. 检测指标：Cd2+
3. 处理：

1. 不接种AM真菌
2. 接种AM真菌

1. 检测位点：扫点+定点

五、具体实验细节：

1. 选择不接种AM真菌的番茄幼苗在100μM CdCl₂中处理1h（处理时间可调整，仅针对扫点实验设计），在分生区（800μm）、伸长区（2500μm）、成熟区（7500μm）各选择一个点进行扫点检测3min，3重复/组

2．根据扫点结果确定定点检测的位置，进行瞬时实验。100μM CdCl₂处理前检测5分钟，100μM CdCl₂处理后检测10分钟，6重复/组

【方案二：瞬时】

1. 材料：番茄
2. 检测指标：Cd2+
3. 处理：

1. 不接种AM真菌
2. 接种AM真菌

1. 检测位点：根伸长区

五、具体实验细节：

100μM CdCl₂处理前检测5分钟，100μM CdCl₂处理后检测10分钟，6重复/组

【方案三：扫点+预处理30天】

1. 材料：番茄
2. 处理：

1. 不接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d
2. 接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：扫点+定点

五、具体实验细节：

1. 选择”不接种AM真菌+100μM CdCl₂”的番茄幼苗，在分生区（800μm）、伸长区（2500μm）、成熟区（7500μm）各选择一个点进行扫点检测3min，3重复/组
2. 根据扫点结果确定定点检测的位置，处理1、2定点检测10分钟，6重复/组

【方案四：预处理30天】

1. 材料：番茄
2. 处理：

1. 不接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d
2. 接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：根伸长区

五、具体实验细节：

处理1、2定点检测10分钟，6重复/组

1. 材料：沉水植物龙舌草
2. 处理：

1. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.05mM KCl
2. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.05mM KCl
3. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.05mM KCl
4. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM KCl
5. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.3mM KCl
6. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.3mM KCl

三、检测指标：H+、Cl-

四、检测位点：叶片表面（正面和反面。非叶肉细胞，不用撕开。）

五、重复：8

六、具体方案

在①-⑥处理30分钟后，在载物台上静置7分钟，定点检测叶片正、反面各5min

七、测试液

H+（提前配置，静置4h以上使用）：

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.05mM KCl，

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.05mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.05mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.3mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.3mM KCl

Cl-：

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.05mM KCl（①-③）

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM KCl（②-⑥）

备注：需要外接10000 lux的光源（检测过程一直照射），以模拟光合作用。

实验一（实验条件摸索）

一、材料：沉水植物龙舌草

二、处理：

1. 对照：0.5 mM NaHCO3+0.5 mM KHCO3（溶液液可能会含有CaCl2）处理15min

三、检测指标：H+、Ca2+、Na+、K+、Cl-可能会加NO3-（优先测H+，看完H+的结果再决定要不要测后面的指标）

四、检测位点：叶片表面正反面

五、重复：8

【具体方案】

1. 摸索时间条件：如果现场检测溶液处理15min后H+的变化不理想，则需要延长处理时间（处理20min、30min等）；如果结果理想，则后续的实验都按照处理15min进行。
2. 摸索检测方法：现场尝试是否可以双传感器（同一个离子）同时检测叶片正反面。
3. 摸索平衡时间：叶片切下后，因为不检测叶肉细胞，所以不需要平衡4h，但是不确定暴露的叶肉细胞平衡多久才不会对检测位点有影响，所以需要切下叶片后持续检测1h，确定平衡时间。（该摸索实验为工程师自己操作，不需要计费）

实验二（正式实验）

一、材料：沉水植物龙舌草

二、处理：

1. 对照：0.5 mM NaHCO3+0.5 mM KHCO3（溶液可能会含有CaCl2）

三、检测指标：H+、Ca2+、Na+、K+、Cl-可能会加NO3-（优先测H+，看完H+的结果再决定要不要测后面的指标）

四、检测位点：叶片表面正反面

五、重复：8

【具体方案】

叶片在溶液中处理15min（根据摸索实验一的结果确定）后，定点检测5min（检测时间可能需要根据实验结果进行延长）

一、材料：沉水植物龙舌草

二、处理：

① 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3

② 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES

三、检测指标：H+

四、检测位点：叶片表面（正面和反面。非叶肉细胞，不用撕开。）

五、重复：8

六、具体方案

在①-⑥处理30分钟后，在载物台上静置7分钟，定点检测叶片正、反面各5min

七、测试液

H+（提前配置，静置4h以上使用，用KOH调节pH）：

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3，pH8.5

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES，pH8.5

备注：需要外接10000 lux的光源（检测过程一直照射），以模拟光合作用。

1. 检测样品：1种不结球白菜
2. 检测部位：根分生区
3. 检测指标：Ca2+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20μM硒胁迫
3. 20μM硒胁迫+50μM药缓解

5. 具体实施方案：

1. 无任何处理组，检测10min数据
2. 硒+药同时处理24h（时长可调整）后，检测10min数据   

6. 重复数：8

检测样品：昆虫

检测部位：触角

检测指标：K+

检测位点及测定时间：扫点测量，每个位点测定稳定数据时间3min

测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mMNa2SO4, pH 6.0

实验1—H⁺、Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：AC
4. 检测指标：H⁺、Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
2. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 27mM CaCl₂处理2h +常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
4. 27mM CaCl₂处理2h +4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、c组定点检测5min
2. b、d组检测15min

（现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。）

1. 重复数：8
2. 测试液

H⁺、Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

实验3—Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：沉默A、沉默B、沉默C、沉默D、沉默E
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
2. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 27mM CaCl₂处理2h+常温+黑暗
4. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+黑暗

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、c组定点检测5min
2. b、d组检测15min

（现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。）

1. 重复数：8
2. 测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

检测样品是：拟南芥；检测部位是：拟南芥下表皮保卫细胞

品种：fim1-1、fim1-2、fim2-2

检测指标：H2O2

处理方式：50 μM ABA处理时间为15min

检测位点：

定点测量
拟南芥下表皮保卫细胞
没有处理的样品检测10min，50 μM ABA处理15min后检测10min

重复数：3

测试液

处理前：2.0mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 5.0 mM MES, pH 6.0；

处理后：50 μM ABA, 2.0mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 5.0 mM MES, pH 6.0

目前能够测定的指标：Ca²⁺、H⁺、Na⁺、K⁺、Cl^-、Mg²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、NH₄⁺、NO₃^-、IAA、O₂、H₂O₂

医学相关生理功能

植物相关生理功能

1. 动物

（1）细胞

神经细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等

（2）组织器官

肿瘤、皮肤、胃粘膜、胰岛、脑（海马体等）、胚胎（大鼠、鱼）、耳蜗、心脏（香螺）、卵（鱼、鸡蛋、爪蟾）、骨骼、角膜、脊椎（豚鼠）、肌肉组织（肌纤维、心肌）

（3）其它生物种类

珊瑚、螨虫、昆虫（果蝇幼虫的肠、蟑螂血脑屏障、按蚊、长红锥蝽）、蝌蚪、水蛭、蓝蟹（微感毛）、变形虫

2. 植物

（1）营养器官

根：根、根毛、根瘤

茎：边材、心材、微管形成层、木质部

叶：表皮细胞、叶肉细胞、盐腺细胞、保卫细胞

（2）生殖器官

花：花瓣、花瓣表皮细胞、花粉

种子：整体、胚

果实：果壳、果皮、果肉（苹果、柑橘）、籽粒、棉花纤维、棉桃

（3）细胞：植物悬浮细胞、液泡

（4）愈伤组织

3. 微生物

酵母细胞、菌丝、微藻、细菌（白腐真菌、大肠杆菌）

4. 非生物材料

合金、泥沙、纳米复合材料

● 由于非损伤微测系统十分灵敏，所以为了文章的成功发表，NMT实验材料的准备工作需要更加严谨。

1. 常见的培养方式有以下几种：

  水培（液体培养基）、平板培养（固体/半固体培养基）、土/沙培。由于非损伤微测系统在测定时需要将样品维持在液体环境中，因此水培样品最易操作。

  可检测的样品部位中，根部的检测经常会涉及到组培苗或是土/沙培苗。如果待测样品无法进行水培，可尝试土/沙培后再进行水培发根。这样培养的样品根部完整，避免影响测试点的选取。并且表面附着的物质也可以通过测试液平衡过程进行去除。从而保证了测试数据的稳定性和准确性。但如果只能在测试前将样品从土壤中或平板上取出，提醒您在取样时一定要小心，以免由于操作失误致使样品受到损伤，从而无法获得真实可靠的实验结果。并建议您取样时多冲洗待测样品根部并适当增加样品的平衡时间。

2. 用于非损伤微测系统检测的样品，绝大多数不需任何额外处理。但为了提升实验成功率，以下事项需要您的重视。本篇以苗期样品为例：

（1）样品苗龄：

请参考NMT文献确定检测使用的样品苗龄。

  a. 需要注意检测不同的部位（根、叶片），样品的苗龄可能不一样；

  b. 不同的实验目的（胁迫处理、营养吸收），样品的苗龄可能不一样。

（2）处理因素：

  a. 如果处理时间较长，按照正常程序处理上即可；

  b. 如果处理时间较短（数小时甚至更短），可以将样品寄送至美国扬格（旭月北京）非损伤测试中心再由工程师行处理。

（3）样品状态：

  活体样品信号非常灵敏，前期的样品准备很重要！不论是培养条件、环境，还是处理条件，都要把握的十分精确，只有这样，得出可用结果的概率才会高。

（4）待测样品挑选：

  待测样品需保证形态比较一致，才会更好地保证实验数据的一致性。因此建议样品数量准备充裕，并挑选一致性较强的样品进行测定。

3. 液泡提取方法

（1）液泡提取方法-烟草叶片

可见附件

（2）液泡提取方法-杨树根

一、所需溶液

1.标准溶液、校正液1、校正液2，按照NISC标准测试液配方配制。

比如检测指标是Ca²⁺，

标准溶液：0.1mM CaCl₂，pH6.0

校正液1：0.5mM CaCl₂，pH6.0

校正液2：0.05mM CaCl₂，pH6.0

2.待尝试测试液、待尝试校正液1、待尝试校正液2，即需要尝试的溶液，比如检测Ca²⁺，测试环境中需要添加10mM glucose，则待尝试溶液配方为：

     待尝试测试液：0.1 mM CaCl₂, 10 mM glucose, pH 6.0

     待尝试校正液1：0.05 mM CaCl₂, 10 mM glucose, pH 6.0

     待尝试校正液2：0.5 mM CaCl₂, 10 mM glucose, pH 6.0

二、尝试流程

1. 使用标准溶液、校正液1、校正液2校正传感器，确保传感器可正常校正，且传感器校正值（斜率）在范围内，在标准测试液中走空白， X-30采样规则下， 监测5分钟稳定数据。（备注1）

2. 同一支传感器再次使用待尝试测试液、待尝试校正液1、待尝试校正液2进行校正，如果传感器可正常校正，且校正值（斜率）在规定范围内（备注2、3），即可进行下一步；如果传感器校正值（斜率）不再规定范围内，则备注4。

3. 在待尝试溶液中校正值（斜率）正常，则在X-30采样规则下，在待尝试测试液中走空白，监测5分钟稳定数据。

4. 若待尝试测试液中空白梯度阈值满足要求，则待尝试溶液满足系统使用要求，可正常使用。若待尝试测试液中梯度阈值不满足要求，则备注5、备注6。

备注：

1、验证待尝试溶液前必须经过标准溶液的检测，确保传感器正常工作。

2、校正值（斜率）及梯度阈值需符合范围，参考如下：

（1）标准斜率范围

   一价阳离子（H⁺、Na⁺、K⁺、NH₄⁺）：

标准溶液53～63mV/decade,尝试环境52～63mV/decade

   一价阴离子（Cl^-、NO₃^-）：

标准溶液-63～-53mV/decade,尝试环境-63～-52mV/decade

   二价阳离子（Ca²⁺、Mg²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺）：

标准溶液25～32mV/decade,尝试环境25～32mV/decade

   分子传感器：

标准溶液与尝试环境标准相同-2000～-9000pA/mM（O₂）、50～90pA/mM（H₂O₂）、250～2000pA/mM（IAA）

（2）空白溶液梯度阈值标准：

离子：±1.5μV

分子：小于±3pA（O₂）、小于±0.5pA（H₂O₂、IAA）

3、同一支传感器下，待尝试溶液校正值（斜率）与标准溶液校正值（斜率）差值范围要求：

   a.离子不超过±1 mV/decade

   b.氧分子不超过±500 pA/mM

   c.过氧化氢不超过±5 pA/mM

   d.IAA不超过±100 pA/mM

4、若待尝试溶液中，传感器校正值（斜率）不再规定范围内，则可更换人员再次配制溶液，重新进行尝试。

5、若待测溶液校正值（斜率）正常，但待测溶液空白梯度阈值不达标，需要重新更换传感器，重新进行尝试。

6、若尝试两次后依然无法达到要求，则需要调整待尝试溶液配方中的药品成分或者浓度配比后再次尝试。

7、若多次尝试后依然无法满足要求，则此配方无法使用。

使用旭月公司设计的溶液配制小工具可以保证配制溶液的准确性！

为了提高实验效率以及得到更好的实验结果，可以选择采购旭月公司提供的溶液。

确定根尖最大流速的位置，常用方法是扫点实验，比如：在根冠、在距离根冠300um、500um、800um……位置分别检测 3～5分钟，6-8个生物学重复，作比较即可。

（1）Toup View软件可以通过物镜测微尺校准软件中的标尺，然后使用软件中的测量功能即可。（可在流速云查看《ToupView摄像头软件图像直线距离测量方法（适用于流速检测软件 imFlxes V2.X）》）
（2）通过运动控制，移动传感器的尖端，来测量视野距离或者样品材料的长度。比如，运动控制步距调整为50um或者100um，打开Motion后通过键盘输入移动指令，即移动50um或者100um。

（1）检查参比电极内部保存溶液是否充足？如果不足，补充3M KCl溶液。
（2）参比电极是否浸没在溶液中？如果不在溶液中，将参比电极放入校正液中。
（3）传感器是否浸没在溶液中？如果不在溶液中，将传感器放入校正液中。
（4）上述步骤无效，取下传感器在传感器制备显微镜下观察尖端是否有气泡，如果有重新制作传感器。

我们的实验室要搬家，能否提供移机服务？

您可以直接联系负责您系统的售后工程师或者拨打售后电话010-82622628。在24小时内，负责该系统的工程师会与您联系，与您沟通确认系统故障原因。在48小时内会为您提供一套解决方案。如果按照该方案系统故障无法解决，那么该工程师会与您沟通上门检修的时间。

我们维修和调试的时间会在3-5天左右（不包括运输的时间），工程师在联系您时都会跟您说清楚。

检查电源线是否插牢；检查显微镜电源开关和亮度调节装置是否打开并工作正常；根据用户手册附录中流程更换新的灯泡；联系售后工程师解决。

（1）检查电源线是否插牢。

（2）检查显微镜电源开关和亮度调节装置是否打开并工作正常。

（3）打开显微镜光源上盖，将灯泡向外拔出约5mm的长度。

（4）根据用户手册附录流程，更换新的灯泡。

参考视频可见附件。

（1）检查电源线是否插牢，如松动，插紧即可。

（2）检查开关是否可以正常按动，如损坏，联系工程师进行维修。

（3）检查保险管是否完好，如果损坏，更换备用保险管。

（1）检查拉门两边的固定插销是否工作正常。

（2）检查滑槽是否磨损严重。如果滑槽部分位置磨损严重，可以选择其他部分进行固定；如果整体磨损严重，请联系负责售后工程师。

（1）检查充气泵的电源线是否插牢，开关是否打开。

（2）检查充气泵的阀门是否打开。

（3）检查连接充气泵和防震台的软管是否连通正常，是否有弯折现象。

（4）如果经过检查后没有发现问题，需要联系工程师进行维修。

时常用吸耳球将运动平台上的，尤其是3个导程螺杆上的尘土吹掉。然后用棉签蘸上无水乙醇彻底擦拭整支导程螺杆，最后点上机油润滑。

（1）检查CCD摄像头与数据采集系统之间的USB连线是否插牢，CCD上的工作指示灯是否点亮。

（2）断开连接摄像头的USB连线，关闭视频采集软件，之后将USB线重新插上，系统识别出硬件后再打开视频软件，按照步骤进行操作（打开软件时一定要等自动弹出的小窗口关闭后再进行之后的操作）。

（3）更换数据采集系统上的USB插口，再次执行以上步骤。

（1）检查运动控制器开关是否打开，电源指示灯是否点亮，电源线是否插牢。

（2）检查运动控制切换Motion开关指示灯是否点亮。

（3）检查连接三维运动平台的排线和连接电脑的数据线是否插牢。

（4）检查鼠标光标操作区域是否在运动控制界面内。

如果您的系统需要维修维护，在维修维护完毕之后再进行报账也可以。

需要更换新的超强度固定连接弹簧，将运动三维拆卸包装寄回进行维修。

（1）换成空白测试液，将传感器（电极）动态信号上下限范围调整为正负1.5uV，观察数据是否在此范围内，如果在此范围，有可能是样品造成的，建议更换样品。

（2）在静态模式下观察传感器（电极）电位，在上下限0.1V范围内是否平稳（一条水平直线）。

（3）在显微镜下观察传感器（电极）尖端是否正常，灌充液是否连续，如出现断层或大的气泡，重新制作传感器（电极）；LIX如果漏光，重新灌充LIX。

（4）检查参比电极内液，如果不充足，补充3M KCl至没过银丝镀层。

（5）检查传感器（电极）固定架上的银丝氯化层是否完好，如果不完好需要重新进行氯化，或者银丝过细更换新的传感器（电极）固定架。

（6）依次更换测试液（标准检测溶液）、传感器（电极）（重新制作，重新蘸LIX，重配灌充液）、更换其他种类传感器（电极）。

（7）将前置放大器两接口用线短接，观察静态电位，如仍然存在静态电位波动，可以给前置放大器外壳接一根地线。

（8）更换前置放大器。

（9）关闭除数据采集系统和信号处理器外的所有设备电源（显微镜最好将电源线也拔下来），之后一次打开各个设备的电源，观察静态电位变化，当打开某一设备电源，静态电位出现明显波动时，需要给该设备及与该设备相连的设备接上地线。其中显微镜的地线需要固定在显微镜背面的内六角螺丝上；电动三维运动平台的电机也需要连接地线（可以连在固定电机的螺丝上）；其他设备接在该设备背面的任意接口螺丝上即可。

（1）换成空白测试液，如果电位能回到正常数值，则可能是样品自身的原因造成电位漂移。

（2）重新校正传感器（电极），看斜率是否能达到要求。

（3）重新制作传感器（电极）， 按步骤操作。

（4）如果还会出现以上现象，依次更换测试液（标准检测溶液）、传感器（电极）、其他种类传感器（电极）。

（5）传感器（电极）Holder可重新打磨氯化，或者更换新的。

（6）更换参比电极。

（7）更换前置放大器。

您可以直接登录流速云，查找下载用户手册电子版使用。

参考视频见附件。

通大气是为了释放传感器（电极）中的气压，防止当传感器（电极）与LIX液面接触时由于气压问题导致灌充液打入到LIX中，造成LIX污染。

如果您的实验频繁，比如每周都有几次试验的话，建议1个星期氯化一次；如果您的实验不频繁，比如1个月才有1次试验的话，建议每次实验前氯化一次。

（1）重新更换100mM KCl溶液

（2）检查两极连接是否正确

（3）电量不足，更换9V电池。

（1）先检查运动开关状态、插拔连接线，

（2）打开数据采集系统重新插拔运动采集卡。

（3）如果还是无法解决，需要联系售后工程师进行返厂维修。

（1）在LIX灌充时可以来回多抽拉几次，使LIX和传感器接触更充分。

（2）传感器在传感器固定架中，保持稳定，不要有晃动。

金属（分子）传感器在Y轴调节“横扫”物镜时，转动三维旋钮时要放慢速度，金属传感器的尖端弹性较大，容易抖动，容易出现看不到虚影的情况。

（1）按照流速云中的测试液配方重新配制测试液。

（2）联系售后工程师解决。

（1）更换新的校正溶液

（2）LIX Holder中的LIX长时间暴露在空气中，已经变质，重新蘸取LIX制作传感器尝试。

（1）检查K⁺ LIX是否已经变短，重新灌充LIX；

（2）查看背景电位变化情况，漂移超出范围重新校正；

（3）重新更换新的传感器。

（1）重新灌充LIX，过程中适当增加LIX反复进出尖端次数（7-8次）。

（2）上述步骤无效，可取一支新的LIX holder吸取一点新的LIX，再重新灌充。

（3）上述步骤无效，可更换一支新的传感器重新制作，如制作3支以上还是存在LIX泄漏的情况，建议更换另一盒传感器再重新制作。

（4）设备运行环境湿度控制在50%-60%，如问题仍不能解决及时联系旭月公司售后人员。

参考视频可见附件。

正常情况下传感器（电极）在一次测试中校正一次，如果测试中发现电位漂移严重即跟在测试液中校正时的电位相比超过正常范围（二价离子超过±5，一价离子超过±10）则需要重新校正。

参考视频

可以依次更换样品的另一个测试点、更换测试液；波动仍然存在，更换空白测试液测定；若没有波动，说明可能是样品问题，更换新样品。

大多数是样品或溶液本身造成的，可以依次更换另一个测试点、更换测试液；波动仍然存在，更换空白测试液测定；若没有波动，说明可能是样品问题，更换新样品。

更换传感器（电极），将灌充液灌充长度稍微增加一点；在其他的测试液中模拟测试，观察LIX是否回缩，确定是否是测试液或样品的问题。

首先关闭软件，重新启动，每次启动时PHMIAS软件都会有一个注册界面，等这个界面缓冲完毕后再进行操作就不会出现上述情况了；如果不行需要联系我们的售后工程师为您解答。

在菜单栏中找到“Capture”，在下拉菜单中选择“start”，然后软件会自动最小化，此时F12截图功能才能正常使用，在每次打开截图软件时都要重复这个步骤。

一是为了确保传感器（电极）能够正常工作，二是为了得到该种离子选择性微传感器（电极）的斜率和截距。

一价阳离子的校正斜率值范围为58±5mv/decade；一价阴离子的校正斜率值范围为-58±5mv/decade；二价阳离子的校正斜率值范围为29±3mv/decade。实际以流速云检测软件中的范围值为准。

在菜单栏中找到“Technique(RawA/D)”,在下拉菜单中找到“ISP/PVP选取相应的采样规则即可。

更换新的校正液尝试；把传感器抬起反复进出液面几次，如还是无法稳定重新制作传感器。

（1）将高浓度的校正液稀释10倍，得到低浓度校正液，重新进行校正。

（2）上述步骤重复两遍无效后，使用待测离子的纯溶液作为两个不同浓度的校正液进行校正，如果此校正液校正出的斜率正常，按照测试方案表中配方，重新配置高、低浓度的校正液和测试液，然后进行校正。

（3）上述步骤无效，更换新的LIX，重新灌充制作传感器。

（4）上述步骤无效，更换参比电极内部保存溶液（3M KCl）。

一般根据样品大小不同，使用不同放大倍数，组织样品较大，则可以根据实际情况，选择较低倍数物镜测定；细胞样品较小，为了测量准确，则必须使用较高倍数物镜。

关闭Montion Control的“MONTION”键，指示灯亮状态是自动调节，指示灯灭才是手动调节状态。

在整个测量过程中，上下左右键是调节传感器方向的，所以当使用键盘输入文本时，避免使用键盘的方向键，否则程序会理解为控制传感器运动，极易造成传感器损坏。

如果样品小幅度发生漂移不用停止测试，测试时传感器也是可以移动的，只要用方向键沿着样品漂移的方向小幅度移动传感器就可以了，移动的距离要确保跟漂移之前的测试位置保持一致。

LIX的灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，传感器（电极）稳定较慢，而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。

 （1）和传感器（电极）、测试液、前置放大器一起构成电路回路。

 （2）提供一个参考电位。

（1）检查信号处理器电源开关是否打开，前置放大器是否连接正确。

（2）将传感器（电极）Holder从放大器上拔出，重新插一遍，不要插的过深。

（3）重新更换校正液。

（4）重新制作传感器（电极），保证LIX、灌充液正确。

如果传感器（电极）是好的，运行几分钟，它就会稳定下来。如果半个小时后还未稳定，请更换一支新传感器（电极）。

请及时联系售后工程师返厂维修。

（1）检查防震台是否未充气。

（2）检查前置放大器、传感器Holder是否未固定牢固。

（3）检查导程螺杆是否长期使用某段量程，造成螺杆的过度磨损，将传感器位置进行移动，换一段导程螺杆的位置进行测试。

（4）检查连接导程螺杆和步进电机的弹簧是否变形。

（5）检查后台软件设置速率是否不合适。

（6）与系统相邻的桌子或操作台是否有人员在使用，影响到传感器（电极）的运动。

（1）检查传感器（电极）在空白溶液中的电位是否正常。

（2）将样品用测试液进行多次冲洗，并更换新的测试液。

（3）延长样品的平衡时间，并且测试前更换新的测试液。

更换采样规则后，在watch界面，点击samp rules,弹出小窗口后点击OK，再点击use new，之后进行测试。

（1）关闭黑屏图，重新截图。

（2）点击video下的live，关闭后再进行截图。

（3）退出ASET程序重新进入。

（1）将运动控制开关关闭，等待运动结束。

（2）联系负责您设备的售后工程师解决此问题。

（1）金属（分子）传感器读取的是电流值，单位pA，离子传感器读取的是电压值，单位mV。

（2）校正界面有所不同，输入浓度的界面，O₂分子是%，离子是mM。IAA、H₂O2分子输入的浓度也是mM。

（3）斜率的电位不同，分子是pA/mM（软件上为pA/percent），离子mV/decade。

进口显微镜目镜是三目镜架，调节三目目镜架的开关（目镜下方按钮），视野恢复正常。

土培样品根系避免直接拔出根系，使用清水清洗出整个根系，保证根系的完整性。在测试前，尽量延长一些平衡的时间，测试前更换新的测试液。

两种方法都可以，但是要看待测细胞的位置方便哪种方式的检测。

传感器在正常运行的状态（可校正、空白）下可以长时间用。

传感器正常运行状态下不用更换。

根据对应的浓度，按照正常溶液配制方法配制，最后用Tris调节pH到达7.0即可。

（1）两点间的运动距离是10um-30um，距离是非常短的。

（2）两点间的运动采集数据时间为6秒左右也是避免这些的原因。

（3）专业的设备提供的运动稳定性也是经过验证的。

（4）实验前的空白也是验证的一个标准。

（5）离子分子在测试液中扩散的速度，远远快于NMT传感器运动的速度。即：在传感器到达一个测量点后的瞬间，离子分子就已经达到了新的浓度动态平衡，而且NMT的设计是该传感器还要在该位置等待一小段时间，因此，NMT技术的两点运动测量方式所带来的溶液扰动不会影响到离子分子流速数据的准确性。

请老师自行到耗材销售平台订购新手环。

参考视频可见附件

• 本篇以水稻幼苗根部为例，两周龄的水稻幼苗，根部呈白色，长度不超过10cm。

准备工具：塑料培养皿、滤纸、树脂块、剪刀、镊子。

具体步骤：

1. 用剪刀将滤纸剪成相同大小的长条（大小根据样品及所选取的培养皿大小来定），之后浸入盛放有测试液的培养皿中，树脂块也一并放进去，进行平衡。

2. 将样品放入测试液中平衡一段时间，具体时间根据情况而定，一般在10min-15min。

3. 用镊子把一条滤纸平放到培养皿底部，将样品放到滤纸上，再用一条滤纸盖住样品。

这里需要注意：

（1） 样品需要测定的位置要露出来，而且尽量露出的少一些，否则在测试中样品可能也会有轻微的飘动，可以用镊子轻拉样品来调节。

（2） 样品露出的位置尽量靠近培养皿中部，可以帮助工程师更好的调节电极的位置。

（3） 操作过程中尽量不要碰到需要测定的根部，以免损伤样品。

4. 为了防止加入溶液后样品飘动，可以用树脂块压住滤纸来固定住样品，需要注意的是最好不要将树脂块直接压在样品上，尤其是压在需要测试的位置上。

5. 像水稻这种整体不是很长的样品，可以将其剩余部分盘绕在培养皿中，但是不要挡住需要测定的部位，最后用滴管向培养皿中缓慢加入测试液，直接倒的话可能会把样品冲跑，测试液的量需要没过样品3-5mm，之后就可以拿来测试了。

（一）镊子撕取法（适用于叶片较大的植物，例如烟草）

准备工具：培养皿、镊子、双面胶、剪刀、毛笔（或小刷子）等。

具体步骤：

1. 剪一小块双面胶粘在干燥的塑料培养皿底待用，面积不宜太大。

2. 用镊子撕取表皮条（下表皮）。撕取下的表皮条需要一部分透明，另一部分留有绿色叶片用于粘连固定样品。

一般情况下，只要肉眼能看见透明的表皮条，其上就会存在待测的保卫细胞，不宜太大，太大容易卷曲。

3. 将带有透明表皮条的叶片部分粘在双面胶上，透明表皮部分露在双面胶之外。为了使得表皮条跟皿之间能够紧贴，可在远离双面胶的地方滴一小滴测试液，粘之前让表皮吸附一些液体（绿色叶片部分尽量不要粘液体），靠张力将表皮条吸在皿底。

4. 用湿毛笔轻轻刷去表皮条表面的叶肉细胞。

5. 加入测试液平衡一段时间（一般为1-2小时，并加入10000～15000Lux的光照）后倒掉，由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂，在平衡过程中可以多更换几次测试液，以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。如果加入测试液后表皮条漂起，再用毛笔轻轻刷一下并更换新鲜的测试液。

（二）胶带粘贴撕取法（适用于叶片较小的植物，例如拟南芥）

准备工具：培养皿、深色绝缘胶带、白色透明胶带（Magic Tape）、剪刀等。

具体步骤：

1．剪取叶片将叶片上表面粘贴在深色绝缘胶带上，并使用剪刀适当修剪叶片边缘。

2．将白色透明胶带边缘剪取一个小的缺口，注意缺口的大小，过大过小都不利于获取叶片的保卫细胞。

3. 使用白色透明胶带带有缺口的地方粘贴叶片的下表皮。

4. 将白色透明胶带撕下，利用两个胶带的粘贴力可以获取叶片下表皮的保卫细胞。

  5. 将撕取的样品粘贴固定到干净的培养皿中。

  6. 加入测试液平衡一段时间（一般为1-2小时，并加入10000～15000Lux的光照）后倒掉，由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂，在平衡过程中可以多更换几次测试液，以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。

● 可以使用此类方法的样品实际上有很多种，例如动植物的细胞、愈伤组织、液泡，单细胞藻类、细菌、酵母菌，再或是花粉粒、花粉管等，固定时整体上遵循一个原则：不管样品是贴壁还是悬浮，需要保证样品在测试过程中不会随意飘动或游动。

本篇以豌豆根部边缘细胞为例。

准备工具：塑料培养皿，旭月公司提供的固定样品玻片，移液枪及枪头，镊子，测试液等。

具体步骤：

1. 取一个干净的培养皿，用移液枪在皿底中间位置滴一滴测试液，然后用镊子夹住一片玻片轻轻压在培养皿底部，防止之后大量加入测试液后玻片漂起来。

2. 用移液枪吸取一定量的样品溶液（具体量依样品而定，一般为100uL-200uL），滴到玻片中间位置，涂抹均匀，然后静置5-10min，使样品能充分被玻片吸附住。

3. 用移液枪吸取一定量测试液，先用镊子轻轻压住玻片边缘，再沿着培养皿边缘缓慢加入测试液，防止玻片漂起来，加入的测试液必须完全没过玻片。

4. 同样沿培养皿边缘用移液枪（或滴管）将皿中测试液吸出（将漂浮的细胞冲掉），然后再加入新鲜的测试液就可以进行测试了。

注意以下事项：

1. 尽量将样品在玻片上涂抹开，让样品充分接触到玻片，这样才能起到作用。

2. 加溶液时，一定要用镊子按住玻片边缘。因为加溶液时很容易将玻片冲起来，在溶液的影响下使得样品被冲到玻片下方，无法测试。所以不仅要按住玻片边缘，更要缓缓加入溶液。

3. 吸取溶液时同样要缓缓的，并且不要伸到液面最低端吸取，这样容易将样品吸走。

● 可以使用此类方法的样品实际上有很多种，例如动植物的细胞、愈伤组织、液泡，单细胞藻类、细菌、酵母菌，再或是花粉粒、花粉管等，固定时整体上遵循一个原则：不管样品是贴壁还是悬浮，需要保证样品在测试过程中不会随意飘动或游动。

本篇以豌豆根部边缘细胞为例。

准备工具：塑料培养皿，旭月公司提供的固定样品玻片，移液枪及枪头，镊子，测试液等。

具体步骤：

1. 取一个干净的培养皿，用移液枪在皿底中间位置滴一滴测试液，然后用镊子夹住一片玻片轻轻压在培养皿底部，防止之后大量加入测试液后玻片漂起来。

2. 用移液枪吸取一定量的样品溶液（具体量依样品而定，一般为100uL-200uL），滴到玻片中间位置，涂抹均匀，然后静置5-10min，使样品能充分被玻片吸附住。

3. 用移液枪吸取一定量测试液，先用镊子轻轻压住玻片边缘，再沿着培养皿边缘缓慢加入测试液，防止玻片漂起来，加入的测试液必须完全没过玻片。

4. 同样沿培养皿边缘用移液枪（或滴管）将皿中测试液吸出（将漂浮的细胞冲掉），然后再加入新鲜的测试液就可以进行测试了。

注意以下事项：

1. 尽量将样品在玻片上涂抹开，让样品充分接触到玻片，这样才能起到作用。

2. 加溶液时，一定要用镊子按住玻片边缘。因为加溶液时很容易将玻片冲起来，在溶液的影响下使得样品被冲到玻片下方，无法测试。所以不仅要按住玻片边缘，更要缓缓加入溶液。

3. 吸取溶液时同样要缓缓的，并且不要伸到液面最低端吸取，这样容易将样品吸走。

● 对于测试鸡蛋、植物果实、合金等不透光的样品来说，倒置显微镜无法满足NMT技术的测试要求，需要使用体视显微镜来进行测试。此类样品的固定方法比较特殊。

本篇以柑橘果实为例，展示体视镜测试中样品的固定方法。

准备工具：将离心管盖或者其它大小适中的盖状容器打孔后的器具、胶水（不影响测试即可）、移液枪等。

具体步骤：

1. 根据测试部位，将待测部位露出，使用移液枪在测试样品表面或者离心管盖子底部涂抹适量的胶水。

2. 将离心管盖固定在待测样品上，固定时可根据情况在胶水少的部位再添加一些胶水，或是用胶水将离心管盖与样品链接缝处粘住，静止一段时间待胶水晾干。

3. 加入蒸馏水冲洗，目的是将胶水表面的物质冲掉，避免对测试信号产生影响。并检查粘贴后的器具是否漏水，如发现漏水则需要重新进行固定。

4. 加入测试液平衡一段时间（一般为10-15min）后倒掉，再加入新鲜的测试液即可进行测试。

数据处理分析

可见附件：数据分析处理流程(iFluxes_V1.0).pdf、数据分析处理流程(imFluxes_V2.0).pdf

非损伤微测技术文章撰写参考资料

可见附件：非损伤微测技术文章撰写参考资料_V5.2——联盟版.pdf

文章撰写资料试剂耗材型号发表的文献

可见附件：C2015-001-Overexpression_of_bacterial_c-glutamylcysteine_synthetase.pdf  

流速传感器工作原理文献

文献里介绍了Ca2+流速传感器结构、组成、LIX如何工作，流速如何测定等等基本问题

可见附件：

Construction,_Theory_and_Practical_Considerations_for_using_Self-Referencing_of_Ca2+-Selective_Microelectrodes_for_Monitoring_Extracellular_Ca2+_Gradients.pdf ‎

• 系统开机前要注意把稳压电源接入插线板的总开关打开，然后再逐一打开系统相关部件电源。
• 冬天由于气温低，空气干燥，开机前要打开空调和加湿器，将室内温度和湿度调节到合适范围（室温22℃-25℃，湿度50%-60%），同时操作者要穿上防静电服。
• 关机时要注意将各部件旋钮及开关放到正确的位置，方便下一次使用，还需要注意将三维运动位移平台的螺杆位置调节到中间，这样才能增加其使用寿命。最后不要忘记关闭总电源。

• 流速传感器开口（尖端直径）很重要，流速传感器的尖端直径决定了实验的空间分辨率及流速传感器的输入电阻，同时流速传感器尖端的形状很大程度上决定着吸附LIX的能力。
• 目前，非损伤微测实验常用的流速传感器开口大小为1-2μm、4-5μm、8-10μm。

流速传感器型号： 
XY-CGQ-01（组织样品专用4-5 μm） 
XY-CGQ-02（细胞样品专用1-2 μm） 
XY-CGQ01（组织样品专用8-10 μm）

• LIX的长度随流速传感器种类不同而不同，一般除K⁺、Cl^-和NO₃^-流速传感器外，LIX长度应在40-50μm，K⁺流速传感器180μm，Cl^-和NO₃^-流速传感器80μm；
• 灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，流速传感器稳定较慢。而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。
• 离子选择性微流速传感器灌充液成分、离子交换剂型号、灌充长度一览表

• NMT测试中的流速传感器校正指的是：将流速传感器放入已知离子浓度（不同浓度，2个或3个）的溶液中读取电压值，以Nernst方程为基础，建立浓度和电压的关系。
• 校正的目的主要有两个：

1. 建立浓度和电压的线性关系，用于流速的计算。同时确定流速传感器是否正常工作。
2. 保证测量结果的准确性。所以需要校正时必须校正。

• 正常情况下流速传感器在一次测试中最少需要校正2次，即测试开始前一次，结束时一次，有些特殊的流速传感器，例如Cl^-流速传感器，为了获得准确的数据，需要多次校正，这属于正常的校正。
• 校正和流速传感器漂移有关，漂移是一个持续的过程，一般来讲，当1价离子电位变化10mV以上,2价离子电位变化5mV以上时,需要再次校正。
• 有的数据在校正前后算得的流速差别很大，造成的原因是因为重新校正后，会得到新的斜率值和截距值，如果没有用新的斜率值和截距值计算数据的话，校正前后算出来的结果就会差的比较大，所以要特别注意。但是有时候，流速差别较大可能往往表现的正是活体样品真实的生理反应，所以样品的选择上要多注意。

• 流速传感器不要碰底部，但最好深入液面较深处；参比电极和离子流速传感器的距离要保持相对固定，不要忽远忽近；在更换校正液之前冲洗参比电极。
• H⁺需要将pH值换算成mM后再输入。
• 以下是常用离子/分子不同浓度校正液相对应的电位值的参考值，不同系统下会有一定偏差，但如果没有特殊情况，电位值应该在这个范围之内。

下表为校正液浓度为0.1mM时，各离子传感器电位的经验值。

• 配制校正液时，最好采用先配制好较高浓度的母液，然后稀释的方法配制，不要直接溶解固体，因为校正液中的离子浓度一般较低（大多数是0.01mM～1mM），直接用固体配的话称量的量会很少，导致误差增大，校正时不能达到理想值。
• 每种离子的校正液要有一高一低两种浓度，原则上是要将测试液中该离子的浓度包含在内，一般高低浓度相差10倍，比如测试液中Na⁺是0.9mM，校正液就可以是0.5mM和5mM。H⁺的话原理一样，调节高低两种pH即可。
• 校正液中除了待测离子外，还应该有测试液中同浓度的其他离子，pH最好也和测试液一致，如果要测定多种离子，可以配制成同一瓶校正液，但校正液中的待测离子浓度要相应改变。
• 由于不同LIX的选择性不同，所以配制校正液时的离子浓度也是有要求的：

1. H⁺：pH4-pH9之间。
2. Na⁺：10mM—0.5mM，而且溶液中K⁺浓度不要高于Na⁺。
3. K⁺：10mM—0.05mM，且溶液中Na⁺浓度不要高于K⁺。
4. Ca²⁺：10mM—0.05mM，且溶液中最好没有Cd²⁺或者浓度低10倍以上。
5. Mg²⁺：10mM—0.1mM，且溶液中最好没有Cd²⁺和Ca²⁺或者浓度低10倍以上。
6. Cd²⁺：1mM—0.005mM，别的离子基本没什么影响。
7. NH₄⁺：10mM—0.05mM，电位可能不是很稳定，可以选用大开口流速传感器，如果测试中电位变化过大可以多校正或更换LIX。
8. NO₃^-：10mM—0.05mM，Cl^-浓度不要太高。
9. Cl^-：10mM—0.5mM，溶液中不能有其他阴离子，可能需要多次校正。

• 调节校正液的pH需注意，不能用含有待测离子的酸或碱调节，如测定Na⁺时调节pH值不能用NaOH，否则就使溶液中的Na⁺含量增加，可用较少量的KOH调节，最好用氯化胆碱或Tris。

• 非损伤微测系统中的参比电极主要有两个作用：

1. 和流速传感器、测试液、前置放大器一起构成电路回路，
2. 提供一个参考电位。

• 使用时要注意以下几点：

1. 灌充溶液时，要将塑料管连接部分从后端拧下来，从后端用流速传感器灌充液的那种细的注射头灌充溶液，参比内液不要灌充太多，浸没过氯化银丝部分1cm即可。
2. 新灌充3M KCl后，需要让氯化银丝在参比内液中浸泡24小时以上，这样电位稳定得快一些。
3. 灌充溶液时，注意保护好内部银丝尖端的氯化银部分，不要私自用砂纸磨或者剪断。
4. 每次使用完毕后，将参比电极浸泡在3MKCL溶液中（即收纳管内），不要暴露在空气中，如果长时间不使用，需要将塑料管中的溶液全部吸出，再用蒸馏水润洗几遍，晾干后保存。

• 当测试过程中出现电位不正常时，可以首先更换传感器（或LIX），排除传感器问题后，最有可能是参比电极的问题，大概有以下几种情况：

1. 静态电位显示+-5.000V：检查参比电极接口是否插入前置放大器接口中，参比电极是否放入测试液中，参比电极中的溶液是否没过银丝尖端。
2. 校正值在正常范围内，但是比起经验值偏大或偏小（比如低于-150mV,高于500mV等），首先确定测试液和流速传感器灌充液浓度是否正确，之后检查参比电极中的灌充液浓度是否正常，可以重新配制后重新灌充；如果还不行的话，可以更换参比电极的塑料管，新的参比电极附带一个备用的。
3. 当电位变化很快时，除了流速传感器的电位漂移外，还有可能是参比电极漏液造成的，可以更换塑料管试试。

• 参比电极位置应尽量远离样品；最好深入液面5mm；测试时尽量将参比电极相对与样品的位置固定。

• 显微镜放大倍数选择原则：

一般根据样品大小不同，使用不同放大倍数。组织样品较大，则可以根据实际情况，选择较低倍数物镜测定；细胞样品相对较小，为了测量准确，则必须使用较高倍数物镜。

• 测试时需保证流速传感器和样品距离的一致性

测试时流速传感器与样品的距离直接决定着测试信号的大小，尤其是信号大的样品，流速传感器距离样品的距离稍微不同，测出来的信号大小也就不一样，因而要保证每次测试时流速传感器与样品距离的一致性。

• 保证流速传感器与样品距离固定的方法

NMT可以用计算机键盘控制传感器在x、y、z方向进行定距离的运动，运动距离大小可以手动输入确定，显示器也用此方法精确测量了所视范围的长和宽，测试工程师可以每次测试时先在显示器范围内找到样品的固定位置，让流速传感器稍稍贴住样品，然后朝所需方向移动流速传感器，从而达到精确定位的目的。

精确定位程度和显示的放大倍数有关，放大倍数越大越精确，目前可以达到40倍；还与流速传感器移动的最小距离有关，现在流速传感器移动最小可以精确到0.5um。

1. 可能在初始测定时会遇到增强的干扰信号和瞬时人工信号。如果流速传感器是好的，运行几分钟，它就会稳定下来。如果半个小时后还未稳定，请更换一支新流速传感器。
2. 如果测试中出现电位在测试液中严重漂移的情况（一价离子电位变化在±10mv以上；二价离子电位变化在±5mv以上），需要重新进行流速传感器校正，并在测试记录表上进行相应的记录。
3. 测试开始时接近样品出现较大波动，此时可以依次更换另一个测试点、更换测试液；波动仍然存在，更换空白测试液测定；若没有波动，说明可能是样品问题，更换新样品。
4. 如果一开始测定时没问题，测试过程中出现波动，大多数是样品或溶液本身造成的，可按上述步骤检测和排除问题。
5. 测试时需要瞬时处理时需要注意，要标记为“add NaCl”，不要标记成“+NaCl”，因为在用EXCEL打开时，单元格中的内容不能显示“+NaCl”，会报错，而“add NaCl”可以显示，不会报错。
6. 离子是外流还是内流，以原始数据中的dV判断最为准确。

请注意当一天中第一次测定时，建议将微流速传感器放入空白测试中进行5分钟的流速测定，观察测定数值，以确保测定数值应在基线附近。

• 极谱分子流速传感器测试

1. 对于极谱分子流速传感器而言，“Raw A/D”模式下显示的数值实际是电流值，单位是“nA”。

• 也可能是样品大部分的区域对K⁺都是外排趋势，导致样品周围整体电位升高，但是测得点确是吸收趋势，也可能导致这种结果。
• 如果流速传感器远离样品时电位恢复，建议先用蒸馏水多冲洗一下样品，平衡时间加长（≈30min）并且更换几次测试液。
• 如果还不行的话，就看看每个样品测试时电位是否变化较大，保证每个样品电位基本一致，也可以继续测试。
• 测试中加入某些药品，尤其是有机物，会对LIX有较大影响，电位会变化很多，需要多加注意！
• 测试前最好做一个空白对照加入药品的实验，如果电位上没有太大变化，可以直接瞬时处理；如果变化较大的话，根据测试需要，建议采取预处理的办法。

测试的时候，测的是K⁺，发现K⁺有个比较大的吸收，但背景电位却是上升的，会出现这种情况，可能是样品在测试前处在一个K⁺含量比较高的环境下，在测试时又没有在测试液中平衡一定时间，所以导致样品周围K⁺含量较测试液高，而样品对溶液中的K+是吸收趋势，最后才导致这种结果。

• 在操作时注意如果numlock灯熄灭时别误操作数字键。

系统操作时方向键上下左右、home/end是三维三个方向的操作键。如果小键盘的numlock灯亮起时，小键盘的数字键就是数字键，输入数字时可以使用；如果numlock灯灭了的状态，4、6（左右）、2、8（上下）、7（home）、1（end）就等于是三维操作运动控制的键盘方向键。

• 用来氯化的电解液的浓度不能太高，用0.1M HCl/KCl即可。
• 氯化的时间适中，30s即可，时间太短氯化效果不好，太长可能会将银丝弄断。
• 电池电力不足会导致银丝氯化效果不好。

1. 动物

（1）细胞

神经细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等

（2）组织器官

肿瘤、皮肤、胃粘膜、胰岛、脑（海马体等）、胚胎（大鼠、鱼）、耳蜗、心脏（香螺）、卵（鱼、鸡蛋、爪蟾）、骨骼、角膜、脊椎（豚鼠）、肌肉组织（肌纤维、心肌）

（3）其它生物种类

珊瑚、螨虫、昆虫（果蝇幼虫的肠、蟑螂血脑屏障、按蚊、长红锥蝽）、蝌蚪、水蛭、蓝蟹（微感毛）、变形虫

2. 植物

（1）营养器官

根：根、根毛、根瘤

茎：边材、心材、微管形成层、木质部

叶：表皮细胞、叶肉细胞、盐腺细胞、保卫细胞

（2）生殖器官

花：花瓣、花瓣表皮细胞、花粉

种子：整体、胚

果实：果壳、果皮、果肉（苹果、柑橘）、籽粒、棉花纤维、棉桃

（3）细胞：植物悬浮细胞、液泡

（4）愈伤组织

3. 微生物

酵母细胞、菌丝、微藻、细菌（白腐真菌、大肠杆菌）

4. 非生物材料

合金、泥沙、纳米复合材料

括号中的数字是传感器的开口大小。非损伤微传感器（4～5um）适用于测试组织样品的H⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺和Pb²⁺的流速，非损伤微传感器（8～10um）适用于测试组织样品的NH₄⁺、NO₃^-和Cl^-离子的流速。

1.保证系统可以流畅且正常运行，减少设备出问题的概率。

2.减轻配件老化，在一定的程度上延长设备的使用寿命。

1. 前置放大器：精密电子元器件，遭遇静电时会发生损坏。

解决方法：                                               

1）系统运行过程中应保证湿度为50%～60% 。                                                      

2）操作过程中，操作人员需要佩戴防静电手腕。  

2.位移传递架：每个方向上的位移传递架都有一定的运动范围，超出此范围会造成损坏。

解决方法：                                                                                                           

1）实验过程中，要时刻关注各方向上位移传递架的位置，尤其是Z轴方向。

2）实验结束后，将各方向上的位移传递架回归原位。  

3.导程螺杆：位移传递架沿此导程螺杆运动。表面不清洁有污垢时，会影响位移传递架的运动，从而影响选择性微传感器的运动。

解决方法：

每月定期清洁三个方向上的导程螺杆。先用吸耳球吹掉附着在上面的尘土，然后用棉签蘸上无水乙醇彻底擦拭整支导程螺杆，最后点上机油润滑即可。  

4. 超低渗固体参比电极（参比电极）：在测量过程中与离子选择性微电极构成回路。其内部含有3M KCl，长时间暴露在空气当中会使内部的溶液缓慢渗出，溶液蒸发后留有KCl粉末。

解决方法：                                

1）实验结束后，应将参比电极插回收纳管中。避免参比电极长时间暴露在空气当中。

 2）每个月定期检查参比电极和收纳管，保证参比电极套管和收纳管内部的3M KCl充足。          

3）如果不慎忘记将参比电极插回收纳管中，参比电极前端已经有了3M KCl粉末。可以将参比电极浸泡在高纯水中，在粉末完全溶解后，重新向参比电极套管内灌充3M KCl。  

通大气是为了释放传感器（电极）中的气压，防止当传感器（电极）与LIX液面接触时由于气压问题导致灌充液打入到LIX中，造成LIX污染。

LIX的灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，传感器（电极）稳定较慢，而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。

• 流速传感器开口（尖端直径）很重要，流速传感器的尖端直径决定了实验的空间分辨率及流速传感器的输入电阻，同时流速传感器尖端的形状很大程度上决定着吸附LIX的能力。
• 目前，非损伤微测实验常用的流速传感器开口大小为1-2μm、4-5μm、8-10μm。

流速传感器型号： 
XY-CGQ-01（组织样品专用4-5 μm） 
XY-CGQ-02（细胞样品专用1-2 μm） 
XY-CGQ01（组织样品专用8-10 μm）

• LIX的长度随流速传感器种类不同而不同，一般除K⁺、Cl^-和NO₃^-流速传感器外，LIX长度应在40-50μm，K⁺流速传感器180μm，Cl^-和NO₃^-流速传感器80μm；
• 灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，流速传感器稳定较慢。而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。
• 离子选择性微流速传感器灌充液成分、离子交换剂型号、灌充长度一览表

• 测试时需保证流速传感器和样品距离的一致性

测试时流速传感器与样品的距离直接决定着测试信号的大小，尤其是信号大的样品，流速传感器距离样品的距离稍微不同，测出来的信号大小也就不一样，因而要保证每次测试时流速传感器与样品距离的一致性。

• 保证流速传感器与样品距离固定的方法

NMT可以用计算机键盘控制传感器在x、y、z方向进行定距离的运动，运动距离大小可以手动输入确定，显示器也用此方法精确测量了所视范围的长和宽，测试工程师可以每次测试时先在显示器范围内找到样品的固定位置，让流速传感器稍稍贴住样品，然后朝所需方向移动流速传感器，从而达到精确定位的目的。

精确定位程度和显示的放大倍数有关，放大倍数越大越精确，目前可以达到40倍；还与流速传感器移动的最小距离有关，现在流速传感器移动最小可以精确到0.5um。

非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technology：NMT）是一种超高灵敏度，非接触、流速为单位，检测材料外部离子分子浓度及其梯度的技术。

离子分子不仅是构成材料的基本元素，同时也是它们与外界环境进行物质及信息交换的重要载体。这种交换过程会在材料表面形成离子分子浓度梯度，非损伤微测技术就是通过检测这些离子分子浓度梯度，揭示金属材料的腐蚀机制，以及生物材料的生物兼容性机理。

随着NMT技术在生命科学和材料科学中的应用持续深入，各种离子分子所参与的功能和机制不断被阐明，相关的民生应用开始加速涌现。比如：医疗精准用药、空气/水微生物（含新冠病毒）污染检测、高通量种子活力生理检测、老年痴呆快速评估、生殖组织细胞活性快速检测、个性化农作物经济施肥评估等等。

离子和分子稳态是所有生命的共同基本特征之一，且是一种动态平衡。它不断微调以响应细胞器、细胞、组织、器官和整个生物体的内部和外部环境变化。 该动态平衡是通过维持各类生物膜两侧的离子和分子浓度梯度来实现的。非损伤微测技术则通过检测这些跨膜运动离子分子形成的浓度梯度，揭示活体材料的离子分子稳态这一生命基本特征，及其相关的生理功能与机制。

非损伤微测技术的诞生及其命名，是许越教授与匡廷云院士、杨福愉院士、林克椿教授等科学家一道，在美国科学家Lionel Jaffe的钙离子振荡电极技术（Vibrating Probe：VP，1974）原理基础上，以2005年创立的旭月（北京）科技有限公司为技术支持和商业后盾，经过分子离子种类扩增，测量精度的大幅提升，测量方式的模块化、⾃动化、专业化、智能化、标准化改进，以及3D立体数据采集及动画演示等新功能的成功研发而成。目前，非损伤微测技术已成为世界上同类型VP技术商业化产品，比如澳洲：MIFE，美国：SIET、SERIS等品牌中的一员，并于2021年通过科技部世界领先评审。

一、材料：拟南芥

二、基因型：WT、转基因1、转基因2

三、处理：200mM NaCl处理

四、检测指标：Na+

五、检测部位：根分生区（过渡区中间）  

六、具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）

【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】

一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。  

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.置于200mM NaCl中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组  

（例如：200mM NaCl处理半小时，测试液50mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH6.0，不需要平衡，放入测试液中直接开始测）

一、材料：拟南芥

二、基因型：WT、转基因1、转基因2

三、处理：200mM NaCl处理24h

四、检测指标：Na+，K+

五、检测部位：根分生区（过渡区中间）  

六、具体方案：  

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】 一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少        

1）对照组 置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a. 200mM NaCl胁迫后，立即检测（200mM NaCl实时处理）

b.置于200mM NaCl中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组（200mM NaCl预处理24h）  

注意：测K+直接在胁迫浓度里测即可，例如测试液：200mM NaCl，0.1 mM KCl，0.1mM CaCl2，pH6.0

一、   材料：拟南芥

二、   基因型：WT、转基因1、转基因2

三、   处理：200mM NaCl处理24h

四、   检测指标：Na+

五、   检测部位：根伸长区

六、   具体方案：

【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

置于200mM NaCl中处理24h后，记录10分钟，8重复/组

测试液：0.5mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH6.0

一、   材料：拟南芥

二、   基因型：WT、转基因1、转基因2

三、   处理：10mM NH4Cl处理24h

四、   检测指标：NH4+

五、   检测部位：根成熟区

六、   具体方案：

置于10mM NH4Cl中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组

测试液：0.1mM NH4Cl，0.1 mM CaCl2，pH6.0

铵外排检测时的样品平衡时间需要尝试，比如平衡20min检测一下、平衡40min检测一下，看看平衡多久能检测到持续稳定的铵外排。

一、   材料：2种茶树

二、   处理：
1）0.01 mM CdCl2瞬时处理
目的：Cd实时处理后，Cd2+吸收和H2O2的信号相对较强，有利益观察不用材料间的差异

2）0.01 mM CdCl2处理12h、48h（时长可调整）
目的：观察Cd长时处理效应

3）0.1 mM CdCl2瞬时处理（浓度可调整）
4）0.1 mM CdCl2处理12h、48h（时长可调整）

三、   检测指标：Cd2+

四、   检测位点：根

（根部Cd定点位置统计：分生区52.94%、伸长区41.18%、成熟区23.53%、根冠11.76%；根部Cd定点优先位置：伸长区）

五、   具体实验细节：
1、Cd2+
1）瞬时处理后建议检测时长为30分钟，根据前2个样品的实际信号变化情况，可现场优化检测时长。

2）12h、48h处理后，检测10分钟稳定数据即可

六、   参考文献
https://mp.weixin.qq.com/s/ghdDSYJqyha59A5_BYFCJg

一、   材料：水稻

二、   基因型/品种：1个对照、1个过表达株系、1个RNAi株系

三、   检测指标：NH4+、NO3-

四、   检测位点：根

五、   重复：8

六、   处理

1. 正常NH4NO3处理3d
2. 低NH4NO3处理3d
3. 高NH4NO3处理3d

【具体方案】

1. 扫点实验：对照样品选取4个重复进行扫点实验，具体检测位点

300μm、800μm、1500μm、2500μm、7500μm，15000μm每个点检测3min

2. 定点实验：根据扫点实验结果，选择NH4+、NO3-吸收最大的点进行定点实验，每个点检测5min

测试费用报价：

扫点：

1（基因型）×1（处理）×1（指标）×6（位点）×4（重复）×132元/样（定点3min）

定点：

3（基因型）×2（指标）×3（实验组）×8（重复）×195元/样（定点：5min）

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant、OE

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

1. 无处理

2. 10 mg/mL chitin处理 24h

3. 病原菌处理24h

4. 10 mg/mL chitin瞬时处理

5. 病原菌瞬时处理

六、具体方案：

处理1、2、3：无处理、10 mg/mL chitin处理24h、病原菌处理24h后，定点检测叶肉细胞10min，8重复/组

处理4、5：10 mg/mL chitin、病原菌处理前检测5min，10 mg/mL chitin、病原菌处理后，检测10分钟（如信号在瞬时处理后10分钟内没有稳定，会延长测试时间），8重复/组

参考文献

保卫细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/YovUAnqOYkIViXUHe0dFWw

叶肉细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/0UZ_cqxDL_zBxQZz4ok7Pg

测试费用报价：

3（基因型）*1（测试指标）*1（测试部位：根）*1（处理方式：chitin瞬时）*8（重复数）*470

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant、OE

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

1. 无处理

2. 10 mg/mL chitin处理 24h

3. 病原菌处理24h

4. 10 mg/mL chitin瞬时处理

5. 病原菌瞬时处理

六、具体方案：

处理1、2、3：无处理、10 mg/mL chitin处理24h、病原菌处理24h后，定点检测叶肉细胞10min，8重复/组

处理4、5：10 mg/mL chitin、病原菌处理前检测5min，10 mg/mL chitin、病原菌处理后，检测10分钟（如信号在瞬时处理后10分钟内没有稳定，会延长测试时间），8重复/组

参考文献

保卫细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/YovUAnqOYkIViXUHe0dFWw

叶肉细胞：https://mp.weixin.qq.com/s/0UZ_cqxDL_zBxQZz4ok7Pg

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant、OE

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

4℃瞬时处理

六、具体方案：

4℃处理前检测5min，4℃处理后，检测10分钟（，8重复/组

一、 材料：拟南芥

二、 基因型：WT、OE

二、检测部位：保卫细胞

三、检测指标：Ca2+、K+、H+

四、处理：

1. 对照

2. 自然干旱胁迫10天

五、具体方案

定点检测5分钟，8重复/组

测试液：2.0mM KCl+0.1mM CaCl2+5.0mM MES，pH6.0（可测K、Ca、H、Cl）

平衡时间：如果检测气孔打开的，照光（10000~20000lux）平衡1h

一、材料：拟南芥

二、品种：WT、mutant

三、检测部位：根内皮层细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理

1 μM Flg22瞬时处理

六、具体方案：

1 μM Flg22瞬时处理前检测5分钟，1 μM Flg22瞬时处理后检测10min，8重复/组

测试液：0.1mM CaCl2, pH 6.0

平衡时间：4 h

一、材料：大白菜
二、基因型/品种：转基因、WT
三、检测部位：根分生区（H+）、根成熟区（Cd2+）
四、检测指标：H+、Cd2+
五、处理：
1)  CK

2)  200mM NaCl处理 2d

六、具体方案：
1. H+、Cd2+
200mM NaCl处理2d后，定点检测10分钟，8重复/组


【参考视频】
1.如何利用非损伤微测系统（NMT）进行Fe2+营养研究？（检测Cd2+的原因）
https://tv.sohu.com/v/dXMvMjQ0NTI0MjEyLzk2MDUxMzEwLnNodG1s.html
有研究发现Fe2+、Zn2+的转运用的都是同一个转运蛋白，该蛋白同时还能转运Cd2+，因为无法直接测Fe2+，那么检测Cd2+流速，如果是吸收的，间接证明了Fe2+也是吸收的，再结合ICP-MS等类似实验，检测植物体内的离子含量，也可以验证Fe2+的吸收。


2.如何通过检测H+流研究植物Fe营养？（检测H+的原因）
https://v.qq.com/x/page/p0521l0uc4t.html
缺铁的情况下，植物为了吸收更多的铁（土壤里的铁都是三价的），会诱导一些ATP酶，把ATP酶放在质膜上诱导生成更多的H+，然后根系泌H+，土壤酸化，三价铁再高铁还原酶的作用下被还原成二价铁，再被吸收。


【参考文献】
C2014-013
标题：Over-expression of the MxIRT1 gene increases iron and zinc content in rice seeds

【方案一：预处理（长时处理）】

1. 材料：柚木（不接种真菌、接种真菌1、接种真菌2）
2. 处理：干旱胁迫（自然干旱）
3. 检测指标：Ca2+、H2O2
4. 检测位点：根
5. 重复：8
6. 具体实验内容

自然干旱10d（时间点可调整）后，定点检测柚木根部5min

【方案二：实时处理】

1. 材料：柚木（不接种真菌、接种真菌1、接种真菌2）
2. 处理：干旱胁迫（20%PEG模拟干旱胁迫，浓度可调整）
3. 检测指标：Ca2+、H2O2
4. 检测位点：根
5. 重复：8
6. 具体实验内容

1. 10%PEG处理前检测5min，10%PEG处理后检测10min

实验目的：干旱胁迫条件下，研究接种丛枝菌根真菌能否促进植物根系过氧化氢的外排以减轻植物的氧化胁迫

实验1—预处理

目的：观察NaHCO3长时处理效应，以及外源钙对碱胁迫下离子平衡的影响。

1. 检测样品：油菜
2. 样品品种：碱敏感品种、耐碱品种
3. 检测部位：叶绿体、叶肉细胞
4. 处理方式：

1. CK
2. 75mM NaHCO3
3. 75mM NaHCO3+ 1mM CaCl₂
4. 75mM NaHCO3+Ca²⁺螯合剂（根施：0.4mM，叶面喷施：0.04mM）

1. 重复数：8
2. 检测指标：Na+、Ca2+、K+

具体方案

75mM NaHCO3、75mM NaHCO3+ 1mM CaCl₂、75mM NaHCO3+Ca2+螯合剂处理3d/5d/10d/20d（时间点可调整，20d是原计划时间，电话里说了需要往前调整）后定点检测10 min。

参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/jgVHMzXIJp8mEvsuT6Ny3w

https://mp.weixin.qq.com/s/hoDMtVPbC0jxqVZnvs7kRA

实验2—实时处理

目的：观察NaHCO3的短时处理效应，及外源钙对碱胁迫下离子平衡的影响。

1. 检测样品：油菜
2. 样品品种：碱敏感品种、耐碱品种
3. 检测部位：叶绿体、叶肉细胞
4. 处理方式：

1. CK
2. 75mM NaHCO3
3. 75mM NaHCO3+ 1mM CaCl₂
4. 75mM NaHCO3+Ca²⁺螯合剂（根施：0.4mM，叶面喷施：0.04mM）

1. 重复数：8
2. 检测指标：Na+、Ca2+、K+

具体方案

1. 75mM NaHCO3处理12h/24h/3d（时间点可调整）后，CaCl₂或Ca²⁺螯合剂实时处理。CaCl₂或Ca²⁺螯合剂处理前检测3min，CaCl₂或Ca²⁺螯合剂处理后检测10min。
2. CaCl₂或Ca²⁺螯合剂处理6h/12h/24h/3d（时间点可调整）后，75mM NaHCO3实时处理。75mM NaHCO3处理前检测3min，75mM NaHCO3处理后检测10min。
3. NaHCO3+Ca²⁺螯合剂同时加入会产生沉淀，因此不采用同时处理的方法。

1. 材料：油菜
2. 品种：耐盐、不耐盐
3. 处理：

1. 对照
2. 150mM Na盐处理
3. 150mM Cl盐处理

1. 检测指标：Na+，K+、Cl-
2. 检测部位：根木质部中柱
3. 具体方案：

1. 瞬时实验：

1. 150mM Na盐/Cl盐处理30min后（时间可以调整，但不宜过长），检测10min

1. 预处理实验：150mM Na盐/Cl盐处理12h、72h后，检测10分钟稳定数据（该处理方式下检测木质部需要尝试）

七：重复数：8

1. 材料：感病、抗病
2. 处理：接种白粉菌1d、3d、5d（时间为假设时间，可根据实际情况进行调整）
3. 检测指标：Ca2+
4. 检测位点：叶肉细胞（感病部位）
5. 重复：8
6. 具体实验内容

对接种白粉菌1d、3d、5d后感病、抗病品种的叶肉细胞进行定点检测10min

执行方案 第一阶段

材料：耐盐，不耐盐

处理：对照（正常培养），盐，盐+硝酸铵

检测指标：钠，钾

具体方案：

1.钠外排（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能促进盐胁迫下，棉花根排Na+速率】

材料：对照组（正常培养的2种样品）

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中，平衡20分钟后检测伸长区（+代表有，-代表无），记录3分钟，8重复/组

b.置于+硝酸铵-盐测试液中，平衡20分钟后检测伸长区，记录3分钟，8重复/组

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐（150 mM NaCl）培养液中处理12小时后，移至-硝酸铵-盐测试液中平衡20分钟，检测伸长区，记录5分钟，8重复/组

b.置于+硝酸铵+盐培养液（20 mM NH4NO3，150 mM NaCl）中处理12小时后，移至+硝酸铵-盐测试液中平衡20分钟，检测伸长区，记录5分钟，8重复/组

3）溶液配方

-硝酸铵-盐测试液：0.5 NaCl，pH 6.0

+硝酸铵-盐测试液：20 NH4NO3，0.5 NaCl，pH 6.0

2.钠吸收（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能抑制盐胁迫下，棉花根的吸Na+速率】

材料：对照组（正常培养的2种样品）

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐处理液中处理20分钟后，置于改良-硝酸铵+盐测试液中，2分钟后直接检测，记录5分钟，8重复/组

b.置于+硝酸铵+盐处理液中处理20分钟后，置于改良+硝酸铵+盐测试液中，2分钟后直接检测，记录5分钟，8重复/组

3）溶液配方

-硝酸铵-盐测试液：0.5 NaCl，pH 6.0

+硝酸铵-盐测试液：20 NH4NO3，0.5 NaCl，pH 6.0

改良-硝酸铵+盐测试液：75 mM NaCl，pH 6.0（7.5/75 mM NaCl，pH 6.0作为高低校正液，斜率符合要求即可）

改良+硝酸铵+盐测试液：20 NH4NO3，75 mM NaCl，pH 6.0（20 NH4NO3，7.5/75 mM NaCl，pH 6.0作为高低校正液，斜率符合要求即可）

-硝酸铵+盐处理液：150 mM NaCl，pH 6.0

+硝酸铵+盐处理液：20 NH4NO3，150 mM NaCl，pH 6.0

初步设计

材料：耐盐，不耐盐

处理：对照，盐，盐+硝酸铵

检测指标：钠，钾

具体方案：

1.钠外排（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能促进盐胁迫下，棉花根排Na+速率】

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐测试液中处理2/6/12小时后，移至-硝酸铵-盐测试液中放置20分钟后检测

b.置于+硝酸铵+盐测试液中处理2/6/12小时后，移至+硝酸铵-盐测试液中放置20分钟后检测

2.钠吸收（测Na+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能抑制盐胁迫下，棉花根的吸Na+速率】

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测（+代表有，-代表无）

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐测试液中处理20/40/60分钟后，直接检测

b.置于+硝酸铵+盐测试液中处理20/40/60分钟后，直接检测

3.钾外排（测K+）

【目的：查看硝酸铵处理是否能抑制盐胁迫下，棉花根排K+速率】

1）对照组

1. 置于-硝酸铵-盐测试液中检测

b.置于+硝酸铵-盐测试液中检测

2）处理组

a.置于-硝酸铵+盐测试液中处理0.25/2/6小时后，直接检测

b.置于+硝酸铵+盐测试液中处理0.25/2/6小时后，直接检测

1. 材料：样品A、样品B、样品C
2. 处理方式：盐胁迫12h（互为对照）
3. 检测位点：定点检测，根分生区
4. 重复数：8

具体方案

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理12h后（时间点可以调整），移至测试液中放置20分钟后检测，记录5分钟，8重复/组
3. K+外排/吸收（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理12h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

1. 材料：小麦
2. 处理：250mM NaCl处理6/12/24/48h后（时间点可以调整）
3. 检测指标：Na+，K+
4. 检测部位：根分生区
5. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测（即250mM NaCl瞬时处理，处理前检测5min，250mM NaCl处理后检测10min）

b.置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

1. 检测样品：小麦、玉米、水稻
2.  检测部位：根伸长区
3. 检测指标：Cd2+
4. 处理

1. CdCl2（对照）处理24h
2. DNP+CdCl2处理24h
3. TEA+CdCl2处理24h
4. Ca2+抑制剂1+CdCl2处理24h
5. Ca2+抑制剂2+CdCl2处理24h
6. H+抑制剂+CdCl2处理24h

5. 具体实施方案：

定点检测5分钟

6.　 重复数：8

【方案一：预处理（长时处理）】

1. 材料：铜绿微囊藻
2. 处理：

1. 橙光+10mg/L KNO3
2. 橙光+10mg/L NH4Cl
3. 红光+10mg/L KNO3
4. 红光+10mg/L NH4Cl
5. 白光+10mg/L KNO3
6. 白光+10mg/L NH4Cl
7. 绿光+10mg/L KNO3
8. 绿光+10mg/L NH4Cl
9. 蓝光+10mg/L KNO3
10. 蓝光+10mg/L NH4Cl

1. 检测指标：NH4+、NO3-
2. 检测位点：藻细胞表面
3. 重复：6
4. 具体实验内容

橙光、红光处理约2h/6h/12h/24h/3d/7d/14d后的样品，定点检测10min

============================

该实验方案设置的时间点较多，一个是可以看出大概处理多久样品的铵硝吸收差异、变化最大（也可以看出样品短时和长时铵硝吸收效应）；另一个是因为NMT检测的是过程量， 发生在结果量之前，建议老师把处理时间往前提。

【方案二：实时处理】

1. 材料：铜绿微囊藻
2. 处理：

1. 10mg/L KNO3
2. 10mg/L NH4Cl

1. 检测指标：NH4+、NO3-
2. 检测位点：藻细胞表面
3. 重复：6
4. 具体实验内容

2500lux的橙光、红光处理前检测3min，2500lux的橙光、红光处理后的样品，定点检测10min

==================

该方案是想看实时处理下，样品的铵硝吸收情况，表现的是短时吸收效应，仅供参考。

一、材料：水稻

二、基因型/品种：WT、mutant

三、检测部位：叶肉细胞

四、检测指标：Ca2+

五、处理：

1. 无处理
2. 10 mg/mL chitin、病原菌处理24h
3. 10 mg/mL chitin、病原菌瞬时处理

六、具体方案：

处理1、2：无处理、10 mg/mL chitin处理24h、病原菌处理24h后，定点检测叶肉细胞10min，8重复/组

处理3：10 mg/mL chitin、病原菌处理前检测5min，10 mg/mL chitin、病原菌处理后，检测10分钟，8重复/组

【方案一：扫点检测】

1. 检测样品：水稻
2. 检测部位：距根尖300、800、1500、2500、7500、15000μm
3. 检测指标：NH4+、NO3-、K+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20nM量子点处理3d

5. 具体实施方案：

对照、20nM量子点处理3d后，进行扫点检测，每个点检测3min

6. 重复数：8

【方案二：定点检测】

1. 检测样品：水稻
2. 检测部位：根成熟区
3. 检测指标：NH4+、NO3-、K+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20nM量子点处理3d

5. 具体实施方案：

 对照、20nM量子点处理3d后定点检测10min

6. 重复数：8

【方案三】

1. 检测样品：水稻
2. 检测部位：扫点+定点
3. 检测指标：NH4+、NO3-、K+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20nM量子点处理3d

5. 具体实施方案：

1）使用对照进行扫点检测距根尖300、800、1500、2500、7500、15000μm这6个位点，4重复

2）根据扫点结果，确定最大吸收位点，进行定点检测，8重复/组

【方案一：预处理（长时处理）】

目的：观察Cd长时处理效应

1. 材料：水稻
2. 处理：

1. 无AMF益生菌
2. 无AMF益生菌+ 5ppm CdCl2
3. 有AMF益生菌
4. 有AMF益生菌+ 5ppm CdCl2

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：根成熟区（Cd2+在成熟区变化较明显）
3. 重复：8
4. 具体实验内容

5ppm CdCl2种植5个月后，定点检测水稻根成熟区5min

【方案二：实时处理】

目的：Cd实时处理后，Cd2+的吸收信号相对较强，有利益观察不用处理间的差异

1. 材料：水稻
2. 处理：

1. 无AMF益生菌，5ppm CdCl2 实时处理
2. 有AMF益生菌，5ppm CdCl2实时处理

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：根成熟区（Cd2+在成熟区变化较明显）
3. 重复：8
4. 具体实验内容

5ppm CdCl2处理前检测5min，5ppm CdCl2处理后检测10min

【方案一】

目的：观察整条根的K+泄露情况

1. 检测样品：水稻
2. 基因型：突变体、WT
3.  检测部位：根分生区、伸长区、成熟区
4. 检测指标：K+
5. 具体实施方案：
   检测距根尖500（分生区）、1500（伸长区）、7500（成熟区）μm这3个位点，每个点检测5分钟
6. 重复数：8

【方案二】

1. 检测样品：水稻
2. 基因型：突变体、WT
3. 检测部位：根分生区
4. 检测指标：K+
5. 具体实施方案：
   定点检测5分钟
6. 重复数：8

一、材料：水稻（WT、OE、RNAi）

二、检测指标：Ca2+

三、检测位点：根分生区过渡区

四、处理：

a.对照

b.0.4mM ZnSO4

c.4mM ZnSO4

五、具体实验细节：

0.4/4mM ZnSO4处理前检测5min，0.4/4mM ZnSO4实时处理后处理后检测10min

六、重复数：8

一、材料：芍药

二、处理：对照、三种真菌侵染根部

三、检测指标：Na+，K+

四、检测部位：根

五、具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）真菌侵染组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）真菌侵染组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），移至测试液中放置20分钟后检测，记录5分钟，8重复/组
3. K+外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）真菌侵染组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

【方案一】

目的：观察纳米颗粒的长时处理效应

1. 材料：青鳉
2. 检测部位：鳃
3. 检测指标：Na+、Cl-、NH4+、H+（pH）
4. 处理：
   3种不同尺寸的纳米颗粒处理1d、3d、5d、7d
5. 具体方案：

定点检测5分钟，8重复/组

【方案二】

目的：纳米颗粒实时处理后信号变化相对较强，有利于观察不用处理间的差异

1. 材料：青鳉
2. 检测部位：鳃
3. 检测指标：Na+、Cl-、NH4+、H+（pH）
4. 处理：
   3种不同尺寸的纳米颗粒实时处理
5. 具体方案：

加入纳米颗粒前检测5分钟，加入纳米颗粒后检测10分钟

一、材料：葡萄

二、检测指标：NH4+、NO3-

三、检测位点：根成熟区、茎、叶肉细胞

【实验目的】在正常的土壤中加入尿素会导致铵态氮会转化成硝态氮，但是植物吸收不了这么多硝态氮就会流失，加入DMPP可以抑制铵态氮向硝态氮转化。这个实验就是探究加入DMPP后铵态氮、硝态氮的利用分配，植株各部位吸收的铵态氮和硝态氮有无增加，对生产中果实产量和品质的影响。

四、重复：6

五、处理

1. 对照
2. 0.1%DMPP
3. 0.2%DMPP
4. 0.3%DMPP

在施肥前1天和施肥后3天检测

【方案一】实时处理

目的：根据经验，实时处理后，NH4+、NO3-的信号变化相对较强，有利于观察不用处理间的差异。

具体内容：DMPP处理前样品检测3min，0.1%、0.2%、0.3%DMPP实时加药处理后，定点检测10min。

【方案二】预处理处理

目的：观察NH4+、NO3-吸收的长时效应

具体内容：0.1%、0.2%、0.3%DMPP处理前1天的样品定点检测5min，0.1%、0.2%、0.3%DMPP处理后3天的样品定点检测5min。

【方案一：预处理（长时处理）】

1. 材料：葡萄
2. 处理：

1. CK
2. 200mM NaCl +0.2mM硫酸铵处理2、4、6d
3. 200mM NaCl +2mM硫酸铵处理2、4、6d

1. 检测指标：Na+、H+、IAA、NO3-、NH4+
2. 检测部位：根分生区过渡区（Na+、H+、IAA）、成熟区（NO3-、NH4+）
3. 具体方案： 

1. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）处理组
   复合溶液处理2、4、6d后，定点检测10分钟，8重复/组
2. H⁺、IAA 、NO3-、NH4+

复合溶液处理2、4、6d后，定点检测10分钟，8重复/组

【方案二：瞬时处理】

1. 材料：葡萄
2. 处理：

1. CK
2. 200mM NaCl +0.2mM硫酸铵处理2、4、6d
3. 200mM NaCl +2mM硫酸铵处理2、4、6d

1. 检测指标：Na+、H+、IAA、NO3-、NH4+
2. 检测部位：根分生区过渡区（Na+、H+、IAA）、成熟区（NO3-、NH4+）
3. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）

【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】

一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

1. 0.2、2mM硫酸铵处理2、4、6d后，200mM NaCl处理0.5h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组

2. H⁺、IAA、NO3-、NH4+

0.2mM、2mM硫酸铵处理2、4、6d后，200mM NaCl瞬时处理前检测3min，200mM NaCl瞬时处理后检测10min

1. 材料：拟南芥
2. 处理：

1. 纯化真菌滤液1
2. 纯化真菌滤液2
3. 纯化真菌滤液3

1. 检测指标：H+
2. 检测部位：根分生区（过渡区中点）
3. 具体方案：

1. 纯化真菌滤液1、2、3处理拟南芥根24h后（处理时间可调整），定点检测10分钟
2. 纯化真菌滤液1、2、3处理前检测5分钟，纯化真菌滤液1、2、3实时处理后检测10分钟

七、重复数：8

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：WT、OE1、OE2、RNAi
3. 检测部位：根分生区（过渡区中点）
4. 检测指标：Ca2+、Na+、K+、Cl-
5. 处理：

1. 150mM NaCl
2. 145mM NaCl+5mM Na2CO3
3. 10%PEG6000

1. 具体方案：

1. Ca2+预处理
   150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG处理6h后（处理时间可调整），定点检测10分钟在，8重复/组
2. Ca2+实时处理
   150mM NaCl、145mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG处理前检测5分钟，150mM NaCl、145mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG处理10min后检测15-20分钟（经费允许可以持续检测30分钟），8重复/组
3. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐碱材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   a.置于150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3中处理0.5/1/2h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
4. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐碱材料的耐受机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   置于150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
5. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐碱胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐碱胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐碱材料，胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）胁迫组

1. 150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG胁迫后，立即检测

b.置于150mM NaCl、145 mM NaCl+5mM Na2CO3、10%PEG中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

6. Cl-方案参考Na+

实验1—Ca2+、H+、K+流速

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：根部伸长区—老师写的是成熟区（距离根冠1000 μm以上）
3. 检测样品品种：WT、HA12#17、HA12#58、HA16#3、HA16#4、HA24#13、HA24#14
4. 处理方式：无处理（对照）、7 mM 的NaHCO3处理24 h-48h（时间点不确定，暂定24和48h）
5. 重复数：8
6. 检测指标：Na+、H+、K+

具体方案

对照组、7mM NaHCO3胁迫24h、48h后定点检测5 min

目的：观察NaHCO3长时处理效应，比较植物耐碱胁迫的能力

参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/jgVHMzXIJp8mEvsuT6Ny3w

https://mp.weixin.qq.com/s/hoDMtVPbC0jxqVZnvs7kRA

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：WT、突变体
3. 检测部位：保卫细胞
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理：10μM ABA实时处理
6. 具体方案：

WT：10μM ABA处理前检测5min，10μM ABA处理后检测20min（3个重复，用于确定信号变化比较大的时间段）

10μM ABA处理前检测5min，10μM ABA处理后检测10min（5个重复，假如根据上面的三个重复确定数据在加药后10min可以稳定，则之后的样品都检测10min）

突变体：10μM ABA处理前检测5min，10μM ABA处理后检测10min（8重复）

一、材料：玫瑰

二、处理：对照、3%NaCl、5%NaCl

三、检测指标：Na+，K+

四、检测部位：根分生区

五、具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），移至测试液中放置20分钟后检测，记录5分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

1. 检测样品：马铃薯
2. 基因型：高积累、低积累
3. 检测部位：根伸长区、茎维管束
4. 处理：50μM CdCl2处理6h、48h
5. 检测指标：Ca2+、Cd2+、H+
6. 具体实施方案：

50μM CdCl2处理6h、48h后，定点检测10分钟，8重复/组

1. 材料：蓝藻
2. 检测指标：NO3-
3. 检测位点：蓝藻细胞定点检测
4. 实验目的：蓝藻在化感物质（黄酮）的胁迫下，硝酸盐的吸收是否受到影响

具体方案

1）实时处理

目的：黄酮实时处理后，NO3-的信号变化相对较强，有利益观察不用处理间的差异

1. 0.1mM黄酮实时处理

方案：瞬时处理前检测3min，瞬时处理后检测10分钟，现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。

2）预处理

目的：观察NO3-长时处理效应

1. 对照，0.1mM黄酮、0.5mM黄酮处理24h
2. 对照，0.1mM黄酮处理6h、24h

方案：处理后检测3min（a、b处理方式均适用）。

六、参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/VSGIRPkre9xckMPdidEwjg

【方案一：NaCl浓度递增处理】

1. 材料：花花柴
2. 处理：
   0、100、200、300、400mM NaCl以递增的方式添加，直到添加到400mM NaCl后，再处理24h。
3. 检测指标：Na+，K+
4. 检测部位：根分生区
5. 具体方案：

1. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理24h后，记录10分钟，8重复/组
2. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测（即100、200、300、400mM NaCl瞬时处理，处理前检测5min，NaCl处理后检测10min）

b.置于盐溶液中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组

【方案二：NaCl直接处理，可能植物有应激反应，但是不会影响离子流速的变化】

1. 材料：花花柴
2. 处理：
   0、100、200、300、400mM NaCl处理6/12/24/48h后（时间点可以调整）
3. 检测指标：Na+，K+
4. 检测部位：根分生区
5. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录0分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测（即100、200、300、400mM NaCl瞬时处理，处理前检测5min，NaCl处理后检测10min）

b.置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

1. 材料：枸杞、番茄
2. 基因型：WT、转基因
3. 处理：100mM NaCl（浓度可调整）
4. 检测指标：Na+，K+
5. 检测部位：根分生区、叶肉细胞
6. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录5分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于盐溶液中处理6/12/24/48h后（时间点可以调整），记录5分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

a.盐胁迫后，立即检测

b.置于盐溶液中处理6、12、24、48h后（时间点可以调整），直接检测，记录5分钟，8重复/组

一、材料：WT、OE、RNAi

二、处理：

1）20 μmM CdCl2瞬时处理（可测根成熟区、根中柱、茎木质部）

目的：Cd实时处理后，Cd2+吸收和H2O2的信号相对较强，有利益观察不用材料间的差异

2）20 μmM CdCl2处理5d（可测根成熟区）

目的：观察Cd长时处理效应

三、检测指标：Cd2+

四、检测位点：根成熟区、根中柱、茎木质部

五、具体实验细节：

1、Cd2+

1）瞬时实验：20 μmM CdCl2处理前检测5min，20 μmM CdCl2实时处理后处理后检测10min

2）预处理实验：20 μmM CdCl2处理5d后，检测10分钟稳定数据即可

六、重复数：8

七、参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/ghdDSYJqyha59A5_BYFCJg

一、材料：柑橘砧木、枳

二、检测指标：H+

三、检测位点：根成熟区

四、重复：8

五、处理

1）低B（10μM硼，0μM铝）

2）低B+Al（10μM硼，300μM铝） 

3）高B（50μM硼，0μM铝）

4）高B+Al（50μM硼，300μM铝）

六、具体方案

实验1：检测排H+速率（Al预处理3h）

目的：观察硼缓解铝毒的长时处理效应

a）低B/高B处理2d（时长可调整），检测5min数据

b）低B/高B处理2d（时长可调整），加入Al处理3h（时长可调整）后，检测5min数据

c）备注：上述方案是B预处理后Al处理（参考PP文章），如有需要，也可以选择B和Al同时处理的方式。

实验2：检测根表H+浓度/pH值（Al预处理3h）

目的：观察B处理后，Al胁迫下根表pH值的变化（NMT可以测根表pH）

具体方案：与实验1一致

实验3：检测Al实时处理后的排H+速率

目的：根据经验，Al实时处理后，H+的信号变化相对较强，有利于观察不用处理间的差异

a）低B/高B处理2d（时长可调整），检测5min数据（如果做了实验1，这个可以不做），实时加入300μM铝试剂，立即持续检测10min数据。

b）实时加入铝试剂后的检测时长，暂定10min，现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如10min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到10min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。

七、参考文献

https://mp.weixin.qq.com/s/Rfl3Cmhf4HmhI7WNA-v6Mg

一、材料：斑马鱼

二、检测指标：H+

三、检测位点：斑马鱼胚胎

四、处理：

a.对照（pH7.0）

b.酸处理（pH5.0）3-4天

c.碱处理（pH8.0/9.0）3-4天

五、具体实验细节：

处理3-4天，出现卵黄囊时开始检测，定点检测10min。

六、重复数：8

测试液：

对照：0.5mM NaCl，0.16mM KH2PO4，0.16mM K2HPO4，0.2mM MgSO4，0.2mM CaSO4，pH7.0

酸处理：0.5mM NaCl，0.16mM KH2PO4，0.16mM K2HPO4，0.2mM MgSO4，0.2mM CaSO4，pH5.0

碱处理：0.5mM NaCl，0.16mM KH2PO4，0.16mM K2HPO4，0.2mM MgSO4，0.2mM CaSO4，10mM NaHCO3，pH8.0/9.0

实验一

1. 材料：大白菜
2. 基因型/品种：自交系A03
3. 检测部位：根分生区（H+）、根成熟区（Cd2+）
4. 检测指标：H+（流速、根表pH）、Cd2+（流速）
5. 处理：

1. CK
2. 200mM NaCl处理 2d

1. 具体方案：

1. H+、Cd2+

200mM NaCl处理2d后，定点检测10分钟在，8重复/组

实验二：离子浓度成像检测

一、材料：大白菜

二、基因型/品种：自交系A03

三、检测部位：根分生区

四、检测指标：H+

五、处理：

1. CK
2. 200mM NaCl处理 2d

1. 材料：大白菜
2. 基因型：自交系A03
3. 检测部位：根分生区（过渡区中点）
4. 检测指标：Ca2+、Na+、K+、Cl-
5. 处理：

1. CK

200mM NaCl处理 2d

1. 具体方案：

1. Ca2+预处理
   200mM NaCl处理6h后（处理时间可调整，因为Ca2+变化较快，所以盐处理时间比较短，处理2天时间较长可能信号变化不明显），定点检测10分钟，8重复/组
2. Ca2+实时处理
   200mM NaCl处理前检测5分钟，200mM NaCl处理10分钟后检测15-20分钟（经费允许可以持续检测30分钟），8重复/组
3. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐碱材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   a.置于200mM NaCl中处理0.5/1/2h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
4. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐碱胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐碱材料的耐受机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）胁迫组
   置于200mM NaCl中处理2d后（时间点可以调整），记录10分钟，8重复/组
5. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐碱胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐碱胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐碱材料，胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）胁迫组

1. 200mM NaCl胁迫后，立即检测

b.置于200mM NaCl中处理48h后（时间点可以调整），直接检测，记录10分钟，8重复/组

6. Cl-方案参考Na+

一、材料：玉米

二、品种/基因型：突变体

三、检测指标：Ca2+

四、检测位点：玉米雌穗幼穗

五、具体实验细节：

突变体穗上正常的小花原基、突变的小花原基（在同一雌穗上）定点各自检测10min

六、重复：8

1. 材料：两个油菜品种
2. 检测指标：Ca²⁺
3. 检测部位：根尖分生区（分生区Ca²⁺信号最明显）
4. 处理：对照、实时0℃低温处理

1. 对照：油菜正常状态下的Ca²⁺信号变化
2. 实时0℃低温处理：检测完正常状态下的Ca²⁺信号变化后，实时把检测环境变成0℃，检测时间不少于15分钟（根据实验的实际情况决定检测时长，以实际检测到的稳定Ca²⁺信号时间为准）

材料：烟草

基因型/品种：PBI121-GFP、PBI121-2.1GFP、PBI121-2.2GFP

检测位点：根分生区

【实验目的】前期的实验是看到了基因可以增强植物的抗逆性，现在想用NMT再验证一下

方案一：预处理—利于观察离子转运的长时效应

【盐胁迫—预处理】

1. 检测指标：Na+、K+
2. Na+吸收（测Na+）
   目的：查看盐胁迫下，谁的根部Na+进入的少。一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，根部吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录3分钟，6重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于250mM盐溶液中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组
3. Na+外排（测Na+）
   目的：查看盐胁迫下，两种植物根部排Na+能力的差异。这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录3分钟，6重复/组
   2）盐胁迫组
   置于250mM盐溶液中处理12h后检测，记录3分钟，6重复/组
4. K+外排/吸收（测K+）

目的：查看盐胁迫下，植物根保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少。一般来说，耐盐材料，盐胁迫下根部排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录5分钟，6重复/组

2）盐胁迫组

置于盐溶液中处理12h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组

【干旱胁迫—预处理】

1. 检测指标：Ca2+、H+
2. 具体方法：10% PEG处理12h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组

【低温胁迫—预处理】

1. 检测指标：Ca2+
2. 具体方法：4℃低温处理12h后，直接检测，记录3分钟，6重复/组

方案二：瞬时处理—根据经验，实时处理后，离子转运信号变化相对较强，利于观察不用处理间的差异。

【盐胁迫—瞬时处理】

1. 检测指标：Na+、K+
2. 具体方法

1. Na+
   250mM NaCl处理前定点检测3min，250mM NaCl处理前处理后定点检测10min，6重复/组
2. K+

250mM NaCl处理前定点检测3min，250mM NaCl处理前处理后定点检测10min，6重复/组

【干旱胁迫—瞬时处理】

1. 检测指标：Ca2+、H+
2. 具体方法：10% PEG处理前定点检测3min，10% PEG处理后定点检测10min，6重复/组

【低温胁迫—瞬时处理】

1. 检测指标：Ca2+
2. 具体方法：4℃低温处理前定点检测3min，4℃低温处理后定点检测10min，6重复/组

方案三

1. 材料：烟草
2. 基因型/品种：PBI121-GFP、PBI121-2.1GFP、PBI121-2.2GFP

三、检测位点：根分生区（过渡区中点）

【实验目的】前期的实验是看到了基因可以增强植物的抗逆性，现在想用NMT再验证一下

【盐胁迫—预处理】

1. 检测指标：Na+、K+
2. 具体方法：150mM NaCl处理24h后，定点检测5min，8重复/组

【干旱胁迫—实时处理】

1. 检测指标：Ca2+、K+
2. 具体方法：

1. Ca2+实时处理：15% PEG处理前检测5分钟，15% PEG处理检测10min，8重复/组
2. K+预处理：15% PEG处理5h后，定点检测5min，8重复/组

【低温胁迫—实时处理】

1. 检测指标：Ca2+、K+
2. 具体方法：

1. Ca2+实时处理：4℃低温处理前检测5分钟，4℃低温处理后检测10min，8重复/组
2. K+预处理：4℃低温处理5h后，定点检测5min，8重复/组

测试液：

1. 盐胁迫测Na+：1mM NaCl，0.1mM CaCl2，pH6.0
   盐胁迫测K+：150mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.1mM KCl，pH6.0
2. 干旱胁迫测Ca2+、K+
   瞬时加药前：0.5mM CaCl2，0.5mM KCl，pH6.0
   瞬时加药后/预处理：15% PEG，0.5mM CaCl2，0.5mM KCl，pH6.0
3. 低温胁迫测Ca2+、K+：0.1mM CaCl2，0.1mM KCl，pH6.0

材料：烤烟

基因型/品种：1个对照、2个过表达株系、2个RNAi株系

检测指标：NH4+、NO3-

检测位点：根

【实验目的】分析不同氨基酸转运蛋白NtTAT（WT、OE、RNAi）NO3-和NH4+在膜上外排和内流的速率，检测氨基酸转运蛋白NtTAT是否直接影响了NO3-和NH4+氮素。

（这是第一步实验，目的是想看烟草对铵硝的偏好性，老师预期是对硝偏好性大一些）

重复：6

【具体方案】

1. 扫点实验：对照样品选取4个重复进行扫点实验，具体检测位点
   1. NH4+：300μm（分生区）、800μm（分生区/伸长区）、1500μm（伸长区/成熟区）、7500μm（成熟区），每个点检测3min
   2. NO3-：800μm（分生区/伸长区）、1500μm（伸长区/成熟区）、2500μm（伸长区）、5000μm（成熟区）、7500μm（成熟区），每个点检测3min
2. 定点实验：根据扫点实验结果，选择NH4+、NO3-吸收/差异最大的点进行定点实验，每个点检测5min

1. 材料：烤烟
2. 基因型/品种：1个对照、2个过表达株系、2个RNAi株系

三、检测指标：NO3-

四、检测位点：根

【实验目的2】检测WT、OE、RNAi在不同浓度NO3-（0、0.1%、0.3%）下处理下氨基酸转运蛋白NtTAT（WT、OE、RNAi）中NO3-流速，探讨过表达氨基酸转运蛋白NtTAT材料是否耐更高浓度氮素

四、重复：8

【具体方案】

1. 不同浓度NO3-处理3天后（时间点可根据实际情况调整），定点检测5min

1. 材料：烤烟
2. 基因型/品种：1个对照、2个过表达株系、2个RNAi株系

三、检测指标：NO3-

四、检测位点：根

【实验目的3】分析氨基酸转运蛋白NtTAT（WT、OE、RNAi）利用不同浓度（假设两个浓度：高、低）的能量阻断剂处理下在合适的NO3­浓度下（0、0.1%）氨基酸转运蛋白NtTAT是否存在依靠能量转运。

四、重复：8

【具体方案】

1. 高、低浓度的能量阻断剂处理3天后（时间点可根据实际情况调整），定点检测5min

一、材料：水稻

二、处理：

1）瞬时处理

目的：Cd实时处理后，Cd2+吸收信号相对较强，有利益观察不同材料、不同处理间的差异

1. CK（20μM CdCl2）
2. CK+5%DCD
3. CK+10%DCD
4. CK+0.5%DMPP
5. CK+1%DMPP

2）预处理7d

目的：观察Cd长时处理效应

1. CK（20μM CdCl2）
2. CK+5%DCD
3. CK+10%DCD
4. CK+0.5%DMPP
5. CK+1%DMPP

三、检测指标：Cd2+

四、检测位点：根成熟区

五、具体实验细节：

1）瞬时处理前（CK）检测3min，5%DCD、10%DCD、0.5%DMPP、1%DMPP瞬时处理后检测15min，现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。

2）5%DCD、10%DCD、0.5%DMPP、1%DMPP处理7d后，检测5分钟稳定数据即可

1. 检测样品：水稻
2. 检测样品品种：玉珍香、湘晚籼12
3. 检测部位：根
4. 检测指标：Cd²⁺、O₂
5. 处理方式：

1. 30 μM CdCl₂+无铁膜（处理3h）
2. 30 μM CdCl₂+有铁膜（处理3h）
3. 5 mM 硅酸钠+30 μM CdCl₂+无铁膜（处理3h）
4. 5 mM 硅酸钠+30 μM CdCl₂+有铁膜（处理3h）

【实验一：扫点检测】

目的：确定Cd2+最大吸收位点

1. 检测位点：水稻根冠顶端、分生区、伸长区、成熟区
2. 测定时间：5min
3. 检测指标：Cd2+
4. 重复数：4

具体内容：检测“30 μM CdCl₂+无铁膜”处理组的样品即可确定后续定点检测的位点。

【实验二：定点检测】

目的：探究铁膜是如何影响镉胁迫下Cd2+转运的。

1. 检测位点：根据扫点结果确定/确定区域中有铁膜的位点和无铁膜的位点
2. 测定时间：5min
3. 检测指标：Cd2+
4. 重复数：8

具体内容： 30μM CdCl2+无铁膜（该处理检测4个重复，其余处理检测8个重复）、30μM CdCl2+有铁膜、5mM 硅酸钠+30μM CdCl2+无铁膜、 5mM 硅酸钠+30 μM CdCl2+有铁膜定点检测5min。

备注：该组实验可以检测同一条根上有铁膜的和没有铁膜的位点，探究在同一条根上，铁膜影响Cd2+吸收的机制。

【实验三：定点检测】

目的：探究O2在铁膜缓解镉胁迫中的作用。

1. 检测位点：根据Cd2+扫点结果确定
2. 测定时间：5min
3. 检测指标：O2
4. 重复数：8

具体内容：30μM CdCl2+无铁膜、30μM CdCl2+有铁膜、5mM 硅酸钠+30μM CdCl2+无铁膜、5mM 硅酸钠+30 μM CdCl2+有铁膜定点检测5min。

【实验四：定点检测】

目的：探究木质部Cd2+的装载能力

1. 检测位点：根木质部
2. 处理：

1. 有/无硅酸钠预处理，Cd实时处理
2. 同时实时处理

1. 测定时间：5min
2. 检测指标：Cd2+
3. 重复数：8

具体内容：Cd/Cd+硅酸钠处理前检测5min，Cd/Cd+硅酸钠处理后检测10min。

1. 材料：山定子砧木
2. 基因型：WT1、WT2、WT3、WT4、OE1、OE2、OE3、OE4
3. 检测部位：根分生区
4. 检测指标：H+
5. 具体方案：

定点检测5min，8重复/组

1. 材料：转基因苹果砧木
2. 检测部位：根成熟区（约距根尖3000μm）
3. 检测指标：NO3-
4. 处理：

1. 低氮（0.3 mM NO3-）处理24 h
2. 低氮24 h +原钒酸钠处理40 min

1. 具体方案：

定点检测5min，4重复/组（根据现场结果可能会增加至8个重复）

一、材料：苹果果实

二、检测部位：病斑处、非病斑处（检测靠近果肉的那一侧）

三、检测指标：Ca2+、Mg2+、K+

四、处理：

1. 正常健康的苹果
2. 发病的病斑中心
3. 病斑边缘1-2mm处
4. 同一个发病的果子上，远离病斑处

五、具体方案：

1. 、2)均选择的靠近花萼一端，定点检测5min，8重复/组

1. 材料：苹果
2. 基因型：EV、iqm
3. 检测部位：根成熟区
4. 检测指标：H+
5. 处理：缺铁处理
6. 具体方案：

定点检测5 min，3重复/组

1. 材料：苹果
2. 检测部位：根分生区
3. 检测指标：H2O2
4. 处理：

1. 40μM FeEDTANa处理0h 3h 6h 9h 12h 1d 3d 6d 9d
2. 0μM FeEDTANa处理0h 3h 6h 9h 12h 1d 3d 6d 9d

1. 具体方案：

0/40μM FeEDTANa处理0h 3h 6h 9h 12h 1d 3d 6d 9d后，定点检测10min，8重复/组

【方案一】

1. 材料：苹果
2. 处理：

1. 0.4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O
2. 0.4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
3. 4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
4. 4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
5. 16 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
6. 16 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养

1. 检测指标：Cu2+
2. 重复：8
3. 检测位点：距根尖400μm
4. 实验方案：

处理20d后的样品，定点检测5分钟稳定数据

【方案二】

1. 材料：苹果
2. 处理：

1. 0.4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O
2. 0.4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
3. 4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
4. 4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
5. 16 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
6. 16 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养

1. 检测指标：Cu2+
2. 重复：8
3. 检测位点：距根尖400μm
4. 实验方案：

处理1d、5d后（时间可以调整）的样品，定点检测5分钟稳定数据

【方案三】

1. 材料：苹果
2. 处理：

1. 0.4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O
2. 0.4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
3. 4 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
4. 4 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
5. 16 mM N处理培养和0.125μM CuSO₄^.5H₂O处理培养
6. 16 mM N处理培养和15μM CuSO₄^.5H₂O处理培养

1. 检测指标：Cu2+
2. 重复：8
3. 检测位点：距根尖400μm
4. 实验方案

处理前检测3min，加药后（具体就是上述1-6种处理）检测10min。

目的：实时处理后，CU2+的吸收信号相对较强，有利益观察不用处理间的差异

【原因】因为您是通过处理20天的样品上看到了表型的差异或者是Cu含量的差异，但是因为这个变化是一个结果量，是积累了一段时间的变化，但是因为NMT检测的是一个过程量，它是发生在结果量之前的，处理20天可能对照组和处理组之间的差异已经比较小了，所以建议可以把处理时间提前一些，目前老师一般都是测得处理时间比较短

方案一

1. 材料：拟南芥
2. 品种：WT、atdfb-3
3. 处理：

1. 9.4mM KNO3处理1d、3d、6d
2. 9.4mM KNO3 +叶酸处理1d、3d、6d（仅处理atdfb-3突变体）

1. 检测指标：NO₃^-
2. 检测部位：根成熟区
3. 具体方案：

处理1d、3d、6d后，检测10分钟稳定数据

七、重复数：6

方案二

1. 材料：拟南芥
2. 品种：WT、atdfb-3
3. 处理：

1. 9.4mM KNO3处理6d
2. 9.4mM KNO3 +叶酸实时处理（仅处理atdfb-3突变体）

1. 检测指标：NO₃^-
2. 检测部位：根成熟区
3. 具体方案：

1. 9.4mM KNO3处理6d后，检测10分钟稳定数据，8重复/组
2. 9.4mM KNO3 +叶酸实时处理前检测5分钟，9.4mM KNO3 +叶酸实时处理后持续检测20分钟（摸索最佳处理时间），4重复/组

测试液

9.4mM KNO3，0.1mM CaCl2，pH6.0

叶酸，9.4mM KNO3，0.1mM CaCl2，pH6.0

2021.9.9

1. 材料：拟南芥
2. 品种：WT、atdfb-3
3. 处理：

1. 9.4mM KNO3处理6d
2. 9.4mM KNO3+50μM叶酸处理6d

1. 检测指标：NO₃^-
2. 检测部位：根成熟区
3. 具体方案：

处理6d后，检测10分钟稳定数据

七、重复数：6

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：转基因1、转基因2、转基因3、转基因4、突变体1
3. 重复数：6

二、处理：

NaCl处理24h

三、检测指标：Na+

四、检测位点：根分生区（过渡区）

五、具体实验细节：

NaCl处理24h后，定点检测5分钟稳定数据

【目的：查看盐胁迫下，不同植物根部排Na+能力差异】

周四早上：

先进行周五早上盐胁迫苗子的处理（需要NaCl胁迫24小时）

周五：

上午对前一天NaCl处理的苗子进行测试

实验1、基因A对盐胁迫介导的跨膜离子流动的影响，共12个样品

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：根
3. 检测样品品种：A和B（*2）
4. 检测指标：Na⁺外排
5. 处理方式：正常培养5~6天后，100mM NaCl处理24h后，放入测试液。
6. 检测位点：扫点：根毛区、分生区、伸长区（*3），优先测根毛区。
7. 测定时间：对照组：检测3分钟（三个区域测同一棵苗，进行扫点）
   盐胁迫组：测5分钟（三个区域测同一棵苗，进行扫点）
8. 重复数：3（*3）
9. 处理液：NaCl（100mM），pH5.8
   测试液：NaCl（0.5mM），pH5.8

实验2、基因A对冷胁迫介导的跨膜离子流动的影响，共12个样品

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：根
3. 检测样品品种：A和B（*2）
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：正常培养后冷胁迫瞬时处理
6. 检测位点：分生区、伸长区（*2），优先测分生区。
7. 测定时间：处理前：检测3分钟
   4℃处理瞬时处理后：检测10分钟
   （处理前处理后测同一棵苗）
8. 重复数：3（*3）
9. 测试液：0.5 mM CaCl_2，pH5.8
   低温测试液：0.5 mM CaCl₂，pH5.8

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：WT、转基因1、转基因2
3. 处理：200mM NaCl处理24h
4. 检测指标：Na+，K+
5. 检测部位：根分生区（过渡区中间）
6. 具体方案：

1. Na+吸收（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，谁的Na+进入的少】
   一般来说，耐盐材料在盐胁迫下，吸Na+速率更小。
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   a.置于200mM NaCl中处理0.5/1/2 h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组
2. Na+外排（测Na+）
   【目的：查看盐胁迫下，两种植物排Na+能力的差异】
   这里已经是更进一步地去发现耐盐材料的耐盐机制，是不是根部排Na+能力更强
   1）对照组
   置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组
   2）盐胁迫组
   置于200mM NaCl中处理24h后，记录10分钟，8重复/组
3. K+吸收/外排（测K+）

【目的：查看盐胁迫下，植物保K+能力，也就是哪种植物在盐胁迫下排出去的K+更少】

一般来说，耐盐材料，盐胁迫下排K+更少

1）对照组

置于测试液中检测，记录10分钟，8重复/组

2）盐胁迫组

1. 200mM NaCl胁迫后，立即检测（200mM NaCl实时处理）

b.置于200mM NaCl中处理24h后，直接检测，记录10分钟，8重复/组（200mM NaCl预处理24h）

【实验一：实时处理】

1. 材料：6日龄拟南芥
2. 基因型：WT、突变体

三、检测指标：Ca²⁺

四、检测位点：根分生区（过渡区）

五、重复：8

【具体方案】

1. 对照组：5 mg/L DMSO 处理前检测5min，5 mg/L DMSO实时处理后检测10 min
2. 处理组：5 mg/L TM处理前检测5min，5 mg/L TM实时处理后检测10 min

备注：对照组、处理组能否只检测一组药品处理前的样品

【实验二：预处理】

1. 材料：6日龄拟南芥
2. 基因型：WT、突变体

三、检测指标：Ca²⁺

四、检测位点：根分生区（过渡区）

五、重复：8

【具体方案】

TM处理0h（对照）、3h、6h后定点检测5min

1. 检测样品：拟南芥
2. 检测部位：保卫细胞
3. 检测样品品种：WT
4. 检测指标： K⁺、Cl-
5. 处理方式：

1. flg22（100 nM）实时处理
2. ABA（10 uM）实时处理
3. flg22+SCREW实时处理
4. ABA+SCREW实时处理

1. 检测位点：保卫细胞定点检测
2. 测定时间：a、b、c、d组加药前检测3min，加药后检测10min（根据前两个样品数据的稳定情况决定后续样品的检测时间）
3. 重复数：6

1. 材料：拟南芥
2. 基因型：野生型、突变体、过表达
3. 处理：50μM ACC处理10min
4. 检测指标：H2O2
5. 检测位点：保卫细胞
6. 重复：3
7. 具体实验内容

50μM ACC处理前检测10min，50μM ACC处理10min后再检测10min

1. 检测样品：棉花
2. 基因型：WT、转基因1、转基因2
3. 检测部位：棉花纤维顶端、侧边
4. 处理：1DPA、3DPA
5. 检测指标：H+
6. 具体实施方案：

所有材料选择同一位置的胚珠上相同区域的纤维细胞进行检测，检测10分钟，8重复/组

=========

测试液：0.1mM CaCl2，pH6.0

【方案一】

1. 材料：梨果实
2. 检测部位：果皮（在注射孔周围取样，检测靠近果肉的那一侧）
3. 检测指标：Ca²⁺（流速）、H2O2（流速）
4. 处理：

1. 注射空载
2. 转基因1
3. 转基因1+2%CaCl₂浸泡5s
4. 转基因2
5. 转基因2+2%CaCl₂浸泡5s
6. 2%CaCl₂实时处理

1. 具体方案：

1、2、3、4、5组处理定点检测10分钟，8重复/组

6组处理2%CaCl₂实时处理后持续监测15分钟，8重复/组

测试液：0.01mM CaCl2，pH6.0

【方案二】

1. 材料：梨果实
2. 检测部位：果皮（在注射孔周围取样，检测靠近果肉的那一侧）
3. 检测指标：Ca2+（检测果实内部质外体浓度）、H2O2（浓度）
4. 处理：

1. 注射空载
2. 转基因1
3. 转基因1+2%CaCl₂浸泡5s
4. 转基因2
5. 转基因2+2%CaCl₂浸泡5s

1. 具体方案：

定点检测，8重复/组

测试液：0.01mM CaCl2，pH6.0

1. 检测样品：黄瓜
2. 基因型：WT、转基因1、转基因2、转基因3
3.  检测部位：根分生区
4. 处理：4℃低温实时处理
5. 检测指标：Ca2+
6. 具体实施方案：

4℃低温处理前（常温）检测10分钟，4℃低温处理后（低温）检测10分钟，8重复/组

【方案一：实时处理】

1. 材料：番茄
2. 处理：干旱胁迫（10%PEG8000）、几丁质胁迫（浓度未定）
3. 检测指标：Ca2+、H2O2、IAA
4. 检测位点：干旱胁迫（根、叶肉细胞、保卫细胞）、几丁质胁迫（叶肉细胞、保卫细胞）
5. 重复：8
6. 具体实验内容

1. 10%PEG处理前检测3min，10%PEG处理后检测10min
2. 几丁质处理前检测3min，几丁质处理后检测10min

【方案二：预处理（长时处理）】

1. 材料：番茄
2. 处理：干旱胁迫（10%PEG8000）、几丁质胁迫（浓度未定）
3. 检测指标：H2O2、IAA
4. 检测位点：干旱胁迫（根、叶肉细胞、保卫细胞）、几丁质胁迫（叶肉细胞、保卫细胞）
5. 重复：8
6. 具体实验内容

10%PEG、几丁质处理4h/6h/12h/24h（时间不宜过长）后，定点检测5min

实验1—IAA、H₂O₂、H⁺、Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：AC
4. 检测指标：IAA、H₂O₂、H⁺、Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+光照（光照持续伴随样品）
2. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
4. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
5. 27mM CaCl₂处理2h+常温+光照（光照持续伴随样品）
6. 27mM CaCl₂处理2h +常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
7. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
8. 27mM CaCl₂处理2h +4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、b、e、f组定点检测5min
2. c、d、g、h组检测20min（先看前2-3个样品的数据稳定情况再进行时间调整）

1. 重复数：8
2. 测试液
   IAA、H₂O₂、H⁺、Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0
3. 光照强度：30000-35000lux

实验2—Ca²⁺成像检测

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：AC
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+光照（光照持续伴随样品）
2. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
4. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
5. 27mM CaCl₂处理2h+常温+光照（光照持续伴随样品）
6. 27mM CaCl₂处理2h +常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
7. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+光照（光照持续伴随样品）
8. 27mM CaCl₂处理2h +4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）

1. 采集位点：0、30、60、90、120、150μm
2. 测定时间：低温处理12h（处理时间待确认）
3. 重复数：8
4. 测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0
5. 光照强度：30000-35000lux

实验3—Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：沉默A、沉默B、沉默C、沉默D
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
2. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 27mM CaCl₂处理2h+常温+黑暗
4. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+黑暗

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、c组定点检测5min
2. b、d组检测20min（先看前2-3个样品的数据稳定情况再进行时间调整）

1. 重复数：8
2. 测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

【方案一：扫点+瞬时】

1. 材料：番茄
2. 检测指标：Cd2+
3. 处理：

1. 不接种AM真菌
2. 接种AM真菌

1. 检测位点：扫点+定点

五、具体实验细节：

1. 选择不接种AM真菌的番茄幼苗在100μM CdCl₂中处理1h（处理时间可调整，仅针对扫点实验设计），在分生区（800μm）、伸长区（2500μm）、成熟区（7500μm）各选择一个点进行扫点检测3min，3重复/组

2．根据扫点结果确定定点检测的位置，进行瞬时实验。100μM CdCl₂处理前检测5分钟，100μM CdCl₂处理后检测10分钟，6重复/组

【方案二：瞬时】

1. 材料：番茄
2. 检测指标：Cd2+
3. 处理：

1. 不接种AM真菌
2. 接种AM真菌

1. 检测位点：根伸长区

五、具体实验细节：

100μM CdCl₂处理前检测5分钟，100μM CdCl₂处理后检测10分钟，6重复/组

【方案三：扫点+预处理30天】

1. 材料：番茄
2. 处理：

1. 不接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d
2. 接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：扫点+定点

五、具体实验细节：

1. 选择”不接种AM真菌+100μM CdCl₂”的番茄幼苗，在分生区（800μm）、伸长区（2500μm）、成熟区（7500μm）各选择一个点进行扫点检测3min，3重复/组
2. 根据扫点结果确定定点检测的位置，处理1、2定点检测10分钟，6重复/组

【方案四：预处理30天】

1. 材料：番茄
2. 处理：

1. 不接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d
2. 接种AM真菌+100μM CdCl₂处理30d

1. 检测指标：Cd2+
2. 检测位点：根伸长区

五、具体实验细节：

处理1、2定点检测10分钟，6重复/组

1. 材料：沉水植物龙舌草
2. 处理：

1. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.05mM KCl
2. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.05mM KCl
3. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.05mM KCl
4. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM KCl
5. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.3mM KCl
6. 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.3mM KCl

三、检测指标：H+、Cl-

四、检测位点：叶片表面（正面和反面。非叶肉细胞，不用撕开。）

五、重复：8

六、具体方案

在①-⑥处理30分钟后，在载物台上静置7分钟，定点检测叶片正、反面各5min

七、测试液

H+（提前配置，静置4h以上使用）：

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.05mM KCl，

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.05mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.05mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM DIDS+0.3mM KCl

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES+0.3mM KCl

Cl-：

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.05mM KCl（①-③）

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.3mM KCl（②-⑥）

备注：需要外接10000 lux的光源（检测过程一直照射），以模拟光合作用。

实验一（实验条件摸索）

一、材料：沉水植物龙舌草

二、处理：

1. 对照：0.5 mM NaHCO3+0.5 mM KHCO3（溶液液可能会含有CaCl2）处理15min

三、检测指标：H+、Ca2+、Na+、K+、Cl-可能会加NO3-（优先测H+，看完H+的结果再决定要不要测后面的指标）

四、检测位点：叶片表面正反面

五、重复：8

【具体方案】

1. 摸索时间条件：如果现场检测溶液处理15min后H+的变化不理想，则需要延长处理时间（处理20min、30min等）；如果结果理想，则后续的实验都按照处理15min进行。
2. 摸索检测方法：现场尝试是否可以双传感器（同一个离子）同时检测叶片正反面。
3. 摸索平衡时间：叶片切下后，因为不检测叶肉细胞，所以不需要平衡4h，但是不确定暴露的叶肉细胞平衡多久才不会对检测位点有影响，所以需要切下叶片后持续检测1h，确定平衡时间。（该摸索实验为工程师自己操作，不需要计费）

实验二（正式实验）

一、材料：沉水植物龙舌草

二、处理：

1. 对照：0.5 mM NaHCO3+0.5 mM KHCO3（溶液可能会含有CaCl2）

三、检测指标：H+、Ca2+、Na+、K+、Cl-可能会加NO3-（优先测H+，看完H+的结果再决定要不要测后面的指标）

四、检测位点：叶片表面正反面

五、重复：8

【具体方案】

叶片在溶液中处理15min（根据摸索实验一的结果确定）后，定点检测5min（检测时间可能需要根据实验结果进行延长）

一、材料：沉水植物龙舌草

二、处理：

① 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3

② 0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES

三、检测指标：H+

四、检测位点：叶片表面（正面和反面。非叶肉细胞，不用撕开。）

五、重复：8

六、具体方案

在①-⑥处理30分钟后，在载物台上静置7分钟，定点检测叶片正、反面各5min

七、测试液

H+（提前配置，静置4h以上使用，用KOH调节pH）：

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3，pH8.5

0.5mM NaHCO3+0.5mM KHCO3+0.2mM DES，pH8.5

备注：需要外接10000 lux的光源（检测过程一直照射），以模拟光合作用。

1. 检测样品：1种不结球白菜
2. 检测部位：根分生区
3. 检测指标：Ca2+
4. 处理方式：

1. 空白对照
2. 20μM硒胁迫
3. 20μM硒胁迫+50μM药缓解

5. 具体实施方案：

1. 无任何处理组，检测10min数据
2. 硒+药同时处理24h（时长可调整）后，检测10min数据   

6. 重复数：8

检测样品：昆虫

检测部位：触角

检测指标：K+

检测位点及测定时间：扫点测量，每个位点测定稳定数据时间3min

测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mMNa2SO4, pH 6.0

实验1—H⁺、Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：AC
4. 检测指标：H⁺、Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
2. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 27mM CaCl₂处理2h +常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
4. 27mM CaCl₂处理2h +4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、c组定点检测5min
2. b、d组检测15min

（现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。）

1. 重复数：8
2. 测试液

H⁺、Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

实验3—Ca²⁺流速

1. 检测样品：番茄
2. 检测部位：叶肉细胞
3. 检测样品品种：沉默A、沉默B、沉默C、沉默D、沉默E
4. 检测指标：Ca²⁺
5. 处理方式：

1. 常温+黑暗（黑暗持续伴随样品）
2. 4℃低温瞬时+黑暗（黑暗持续伴随样品）
3. 27mM CaCl₂处理2h+常温+黑暗
4. 27mM CaCl₂处理2h+4℃低温瞬时+黑暗

1. 检测位点：叶肉细胞定点检测
2. 测定时间：

1. a、c组定点检测5min
2. b、d组检测15min

（现场会根据前2个样品的实际信号变化情况，优化实时处理后的检测时长。例如15min后信号还在持续变化，则延长实时处理后的检测时长；如不到15min信号已经处于稳定期，则缩短实时处理后的检测时长。）

1. 重复数：8
2. 测试液：0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0

检测样品是：拟南芥；检测部位是：拟南芥下表皮保卫细胞

品种：fim1-1、fim1-2、fim2-2

检测指标：H2O2

处理方式：50 μM ABA处理时间为15min

检测位点：

定点测量
拟南芥下表皮保卫细胞
没有处理的样品检测10min，50 μM ABA处理15min后检测10min

重复数：3

测试液

处理前：2.0mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 5.0 mM MES, pH 6.0；

处理后：50 μM ABA, 2.0mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 5.0 mM MES, pH 6.0

我们的实验室要搬家，能否提供移机服务？

您可以直接联系负责您系统的售后工程师或者拨打售后电话010-82622628。在24小时内，负责该系统的工程师会与您联系，与您沟通确认系统故障原因。在48小时内会为您提供一套解决方案。如果按照该方案系统故障无法解决，那么该工程师会与您沟通上门检修的时间。

我们维修和调试的时间会在3-5天左右（不包括运输的时间），工程师在联系您时都会跟您说清楚。

检查电源线是否插牢；检查显微镜电源开关和亮度调节装置是否打开并工作正常；根据用户手册附录中流程更换新的灯泡；联系售后工程师解决。

（1）检查电源线是否插牢。

（2）检查显微镜电源开关和亮度调节装置是否打开并工作正常。

（3）打开显微镜光源上盖，将灯泡向外拔出约5mm的长度。

（4）根据用户手册附录流程，更换新的灯泡。

参考视频可见附件。

（1）检查电源线是否插牢，如松动，插紧即可。

（2）检查开关是否可以正常按动，如损坏，联系工程师进行维修。

（3）检查保险管是否完好，如果损坏，更换备用保险管。

（1）检查拉门两边的固定插销是否工作正常。

（2）检查滑槽是否磨损严重。如果滑槽部分位置磨损严重，可以选择其他部分进行固定；如果整体磨损严重，请联系负责售后工程师。

（1）检查充气泵的电源线是否插牢，开关是否打开。

（2）检查充气泵的阀门是否打开。

（3）检查连接充气泵和防震台的软管是否连通正常，是否有弯折现象。

（4）如果经过检查后没有发现问题，需要联系工程师进行维修。

时常用吸耳球将运动平台上的，尤其是3个导程螺杆上的尘土吹掉。然后用棉签蘸上无水乙醇彻底擦拭整支导程螺杆，最后点上机油润滑。

（1）检查CCD摄像头与数据采集系统之间的USB连线是否插牢，CCD上的工作指示灯是否点亮。

（2）断开连接摄像头的USB连线，关闭视频采集软件，之后将USB线重新插上，系统识别出硬件后再打开视频软件，按照步骤进行操作（打开软件时一定要等自动弹出的小窗口关闭后再进行之后的操作）。

（3）更换数据采集系统上的USB插口，再次执行以上步骤。

（1）检查运动控制器开关是否打开，电源指示灯是否点亮，电源线是否插牢。

（2）检查运动控制切换Motion开关指示灯是否点亮。

（3）检查连接三维运动平台的排线和连接电脑的数据线是否插牢。

（4）检查鼠标光标操作区域是否在运动控制界面内。

如果您的系统需要维修维护，在维修维护完毕之后再进行报账也可以。

需要更换新的超强度固定连接弹簧，将运动三维拆卸包装寄回进行维修。

（1）换成空白测试液，将传感器（电极）动态信号上下限范围调整为正负1.5uV，观察数据是否在此范围内，如果在此范围，有可能是样品造成的，建议更换样品。

（2）在静态模式下观察传感器（电极）电位，在上下限0.1V范围内是否平稳（一条水平直线）。

（3）在显微镜下观察传感器（电极）尖端是否正常，灌充液是否连续，如出现断层或大的气泡，重新制作传感器（电极）；LIX如果漏光，重新灌充LIX。

（4）检查参比电极内液，如果不充足，补充3M KCl至没过银丝镀层。

（5）检查传感器（电极）固定架上的银丝氯化层是否完好，如果不完好需要重新进行氯化，或者银丝过细更换新的传感器（电极）固定架。

（6）依次更换测试液（标准检测溶液）、传感器（电极）（重新制作，重新蘸LIX，重配灌充液）、更换其他种类传感器（电极）。

（7）将前置放大器两接口用线短接，观察静态电位，如仍然存在静态电位波动，可以给前置放大器外壳接一根地线。

（8）更换前置放大器。

（9）关闭除数据采集系统和信号处理器外的所有设备电源（显微镜最好将电源线也拔下来），之后一次打开各个设备的电源，观察静态电位变化，当打开某一设备电源，静态电位出现明显波动时，需要给该设备及与该设备相连的设备接上地线。其中显微镜的地线需要固定在显微镜背面的内六角螺丝上；电动三维运动平台的电机也需要连接地线（可以连在固定电机的螺丝上）；其他设备接在该设备背面的任意接口螺丝上即可。

（1）换成空白测试液，如果电位能回到正常数值，则可能是样品自身的原因造成电位漂移。

（2）重新校正传感器（电极），看斜率是否能达到要求。

（3）重新制作传感器（电极）， 按步骤操作。

（4）如果还会出现以上现象，依次更换测试液（标准检测溶液）、传感器（电极）、其他种类传感器（电极）。

（5）传感器（电极）Holder可重新打磨氯化，或者更换新的。

（6）更换参比电极。

（7）更换前置放大器。

1.保证系统可以流畅且正常运行，减少设备出问题的概率。

2.减轻配件老化，在一定的程度上延长设备的使用寿命。

1. 前置放大器：精密电子元器件，遭遇静电时会发生损坏。

解决方法：                                               

1）系统运行过程中应保证湿度为50%～60% 。                                                      

2）操作过程中，操作人员需要佩戴防静电手腕。  

2.位移传递架：每个方向上的位移传递架都有一定的运动范围，超出此范围会造成损坏。

解决方法：                                                                                                           

1）实验过程中，要时刻关注各方向上位移传递架的位置，尤其是Z轴方向。

2）实验结束后，将各方向上的位移传递架回归原位。  

3.导程螺杆：位移传递架沿此导程螺杆运动。表面不清洁有污垢时，会影响位移传递架的运动，从而影响选择性微传感器的运动。

解决方法：

每月定期清洁三个方向上的导程螺杆。先用吸耳球吹掉附着在上面的尘土，然后用棉签蘸上无水乙醇彻底擦拭整支导程螺杆，最后点上机油润滑即可。  

4. 超低渗固体参比电极（参比电极）：在测量过程中与离子选择性微电极构成回路。其内部含有3M KCl，长时间暴露在空气当中会使内部的溶液缓慢渗出，溶液蒸发后留有KCl粉末。

解决方法：                                

1）实验结束后，应将参比电极插回收纳管中。避免参比电极长时间暴露在空气当中。

 2）每个月定期检查参比电极和收纳管，保证参比电极套管和收纳管内部的3M KCl充足。          

3）如果不慎忘记将参比电极插回收纳管中，参比电极前端已经有了3M KCl粉末。可以将参比电极浸泡在高纯水中，在粉末完全溶解后，重新向参比电极套管内灌充3M KCl。  

• 本篇以水稻幼苗根部为例，两周龄的水稻幼苗，根部呈白色，长度不超过10cm。

准备工具：塑料培养皿、滤纸、树脂块、剪刀、镊子。

具体步骤：

1. 用剪刀将滤纸剪成相同大小的长条（大小根据样品及所选取的培养皿大小来定），之后浸入盛放有测试液的培养皿中，树脂块也一并放进去，进行平衡。

2. 将样品放入测试液中平衡一段时间，具体时间根据情况而定，一般在10min-15min。

3. 用镊子把一条滤纸平放到培养皿底部，将样品放到滤纸上，再用一条滤纸盖住样品。

这里需要注意：

（1） 样品需要测定的位置要露出来，而且尽量露出的少一些，否则在测试中样品可能也会有轻微的飘动，可以用镊子轻拉样品来调节。

（2） 样品露出的位置尽量靠近培养皿中部，可以帮助工程师更好的调节电极的位置。

（3） 操作过程中尽量不要碰到需要测定的根部，以免损伤样品。

4. 为了防止加入溶液后样品飘动，可以用树脂块压住滤纸来固定住样品，需要注意的是最好不要将树脂块直接压在样品上，尤其是压在需要测试的位置上。

5. 像水稻这种整体不是很长的样品，可以将其剩余部分盘绕在培养皿中，但是不要挡住需要测定的部位，最后用滴管向培养皿中缓慢加入测试液，直接倒的话可能会把样品冲跑，测试液的量需要没过样品3-5mm，之后就可以拿来测试了。

（一）镊子撕取法（适用于叶片较大的植物，例如烟草）

准备工具：培养皿、镊子、双面胶、剪刀、毛笔（或小刷子）等。

具体步骤：

1. 剪一小块双面胶粘在干燥的塑料培养皿底待用，面积不宜太大。

2. 用镊子撕取表皮条（下表皮）。撕取下的表皮条需要一部分透明，另一部分留有绿色叶片用于粘连固定样品。

一般情况下，只要肉眼能看见透明的表皮条，其上就会存在待测的保卫细胞，不宜太大，太大容易卷曲。

3. 将带有透明表皮条的叶片部分粘在双面胶上，透明表皮部分露在双面胶之外。为了使得表皮条跟皿之间能够紧贴，可在远离双面胶的地方滴一小滴测试液，粘之前让表皮吸附一些液体（绿色叶片部分尽量不要粘液体），靠张力将表皮条吸在皿底。

4. 用湿毛笔轻轻刷去表皮条表面的叶肉细胞。

5. 加入测试液平衡一段时间（一般为1-2小时，并加入10000～15000Lux的光照）后倒掉，由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂，在平衡过程中可以多更换几次测试液，以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。如果加入测试液后表皮条漂起，再用毛笔轻轻刷一下并更换新鲜的测试液。

（二）胶带粘贴撕取法（适用于叶片较小的植物，例如拟南芥）

准备工具：培养皿、深色绝缘胶带、白色透明胶带（Magic Tape）、剪刀等。

具体步骤：

1．剪取叶片将叶片上表面粘贴在深色绝缘胶带上，并使用剪刀适当修剪叶片边缘。

2．将白色透明胶带边缘剪取一个小的缺口，注意缺口的大小，过大过小都不利于获取叶片的保卫细胞。

3. 使用白色透明胶带带有缺口的地方粘贴叶片的下表皮。

4. 将白色透明胶带撕下，利用两个胶带的粘贴力可以获取叶片下表皮的保卫细胞。

  5. 将撕取的样品粘贴固定到干净的培养皿中。

  6. 加入测试液平衡一段时间（一般为1-2小时，并加入10000～15000Lux的光照）后倒掉，由于撕取表皮的过程中会造成叶片细胞的破裂，在平衡过程中可以多更换几次测试液，以保证平衡效果。平衡结束后需要更换新鲜测试液即可测试。

● 可以使用此类方法的样品实际上有很多种，例如动植物的细胞、愈伤组织、液泡，单细胞藻类、细菌、酵母菌，再或是花粉粒、花粉管等，固定时整体上遵循一个原则：不管样品是贴壁还是悬浮，需要保证样品在测试过程中不会随意飘动或游动。

本篇以豌豆根部边缘细胞为例。

准备工具：塑料培养皿，旭月公司提供的固定样品玻片，移液枪及枪头，镊子，测试液等。

具体步骤：

1. 取一个干净的培养皿，用移液枪在皿底中间位置滴一滴测试液，然后用镊子夹住一片玻片轻轻压在培养皿底部，防止之后大量加入测试液后玻片漂起来。

2. 用移液枪吸取一定量的样品溶液（具体量依样品而定，一般为100uL-200uL），滴到玻片中间位置，涂抹均匀，然后静置5-10min，使样品能充分被玻片吸附住。

3. 用移液枪吸取一定量测试液，先用镊子轻轻压住玻片边缘，再沿着培养皿边缘缓慢加入测试液，防止玻片漂起来，加入的测试液必须完全没过玻片。

4. 同样沿培养皿边缘用移液枪（或滴管）将皿中测试液吸出（将漂浮的细胞冲掉），然后再加入新鲜的测试液就可以进行测试了。

注意以下事项：

1. 尽量将样品在玻片上涂抹开，让样品充分接触到玻片，这样才能起到作用。

2. 加溶液时，一定要用镊子按住玻片边缘。因为加溶液时很容易将玻片冲起来，在溶液的影响下使得样品被冲到玻片下方，无法测试。所以不仅要按住玻片边缘，更要缓缓加入溶液。

3. 吸取溶液时同样要缓缓的，并且不要伸到液面最低端吸取，这样容易将样品吸走。

● 可以使用此类方法的样品实际上有很多种，例如动植物的细胞、愈伤组织、液泡，单细胞藻类、细菌、酵母菌，再或是花粉粒、花粉管等，固定时整体上遵循一个原则：不管样品是贴壁还是悬浮，需要保证样品在测试过程中不会随意飘动或游动。

本篇以豌豆根部边缘细胞为例。

准备工具：塑料培养皿，旭月公司提供的固定样品玻片，移液枪及枪头，镊子，测试液等。

具体步骤：

1. 取一个干净的培养皿，用移液枪在皿底中间位置滴一滴测试液，然后用镊子夹住一片玻片轻轻压在培养皿底部，防止之后大量加入测试液后玻片漂起来。

2. 用移液枪吸取一定量的样品溶液（具体量依样品而定，一般为100uL-200uL），滴到玻片中间位置，涂抹均匀，然后静置5-10min，使样品能充分被玻片吸附住。

3. 用移液枪吸取一定量测试液，先用镊子轻轻压住玻片边缘，再沿着培养皿边缘缓慢加入测试液，防止玻片漂起来，加入的测试液必须完全没过玻片。

4. 同样沿培养皿边缘用移液枪（或滴管）将皿中测试液吸出（将漂浮的细胞冲掉），然后再加入新鲜的测试液就可以进行测试了。

注意以下事项：

1. 尽量将样品在玻片上涂抹开，让样品充分接触到玻片，这样才能起到作用。

2. 加溶液时，一定要用镊子按住玻片边缘。因为加溶液时很容易将玻片冲起来，在溶液的影响下使得样品被冲到玻片下方，无法测试。所以不仅要按住玻片边缘，更要缓缓加入溶液。

3. 吸取溶液时同样要缓缓的，并且不要伸到液面最低端吸取，这样容易将样品吸走。

● 对于测试鸡蛋、植物果实、合金等不透光的样品来说，倒置显微镜无法满足NMT技术的测试要求，需要使用体视显微镜来进行测试。此类样品的固定方法比较特殊。

本篇以柑橘果实为例，展示体视镜测试中样品的固定方法。

准备工具：将离心管盖或者其它大小适中的盖状容器打孔后的器具、胶水（不影响测试即可）、移液枪等。

具体步骤：

1. 根据测试部位，将待测部位露出，使用移液枪在测试样品表面或者离心管盖子底部涂抹适量的胶水。

2. 将离心管盖固定在待测样品上，固定时可根据情况在胶水少的部位再添加一些胶水，或是用胶水将离心管盖与样品链接缝处粘住，静止一段时间待胶水晾干。

3. 加入蒸馏水冲洗，目的是将胶水表面的物质冲掉，避免对测试信号产生影响。并检查粘贴后的器具是否漏水，如发现漏水则需要重新进行固定。

4. 加入测试液平衡一段时间（一般为10-15min）后倒掉，再加入新鲜的测试液即可进行测试。

• 显微镜放大倍数选择原则：

一般根据样品大小不同，使用不同放大倍数。组织样品较大，则可以根据实际情况，选择较低倍数物镜测定；细胞样品相对较小，为了测量准确，则必须使用较高倍数物镜。

数据处理分析

可见附件：数据分析处理流程(iFluxes_V1.0).pdf、数据分析处理流程(imFluxes_V2.0).pdf

非损伤微测技术文章撰写参考资料

可见附件：非损伤微测技术文章撰写参考资料_V5.2——联盟版.pdf

文章撰写资料试剂耗材型号发表的文献

可见附件：C2015-001-Overexpression_of_bacterial_c-glutamylcysteine_synthetase.pdf  

流速传感器工作原理文献

文献里介绍了Ca2+流速传感器结构、组成、LIX如何工作，流速如何测定等等基本问题

可见附件：

Construction,_Theory_and_Practical_Considerations_for_using_Self-Referencing_of_Ca2+-Selective_Microelectrodes_for_Monitoring_Extracellular_Ca2+_Gradients.pdf ‎

• 系统开机前要注意把稳压电源接入插线板的总开关打开，然后再逐一打开系统相关部件电源。
• 冬天由于气温低，空气干燥，开机前要打开空调和加湿器，将室内温度和湿度调节到合适范围（室温22℃-25℃，湿度50%-60%），同时操作者要穿上防静电服。
• 关机时要注意将各部件旋钮及开关放到正确的位置，方便下一次使用，还需要注意将三维运动位移平台的螺杆位置调节到中间，这样才能增加其使用寿命。最后不要忘记关闭总电源。

• 流速传感器开口（尖端直径）很重要，流速传感器的尖端直径决定了实验的空间分辨率及流速传感器的输入电阻，同时流速传感器尖端的形状很大程度上决定着吸附LIX的能力。
• 目前，非损伤微测实验常用的流速传感器开口大小为1-2μm、4-5μm、8-10μm。

流速传感器型号： 
XY-CGQ-01（组织样品专用4-5 μm） 
XY-CGQ-02（细胞样品专用1-2 μm） 
XY-CGQ01（组织样品专用8-10 μm）

• LIX的长度随流速传感器种类不同而不同，一般除K⁺、Cl^-和NO₃^-流速传感器外，LIX长度应在40-50μm，K⁺流速传感器180μm，Cl^-和NO₃^-流速传感器80μm；
• 灌充长度影响尖端的电阻，灌充过长的话电阻增大，流速传感器稳定较慢。而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。
• 离子选择性微流速传感器灌充液成分、离子交换剂型号、灌充长度一览表

• NMT测试中的流速传感器校正指的是：将流速传感器放入已知离子浓度（不同浓度，2个或3个）的溶液中读取电压值，以Nernst方程为基础，建立浓度和电压的关系。
• 校正的目的主要有两个：

1. 建立浓度和电压的线性关系，用于流速的计算。同时确定流速传感器是否正常工作。
2. 保证测量结果的准确性。所以需要校正时必须校正。

• 正常情况下流速传感器在一次测试中最少需要校正2次，即测试开始前一次，结束时一次，有些特殊的流速传感器，例如Cl^-流速传感器，为了获得准确的数据，需要多次校正，这属于正常的校正。
• 校正和流速传感器漂移有关，漂移是一个持续的过程，一般来讲，当1价离子电位变化10mV以上,2价离子电位变化5mV以上时,需要再次校正。
• 有的数据在校正前后算得的流速差别很大，造成的原因是因为重新校正后，会得到新的斜率值和截距值，如果没有用新的斜率值和截距值计算数据的话，校正前后算出来的结果就会差的比较大，所以要特别注意。但是有时候，流速差别较大可能往往表现的正是活体样品真实的生理反应，所以样品的选择上要多注意。

• 流速传感器不要碰底部，但最好深入液面较深处；参比电极和离子流速传感器的距离要保持相对固定，不要忽远忽近；在更换校正液之前冲洗参比电极。
• H⁺需要将pH值换算成mM后再输入。
• 以下是常用离子/分子不同浓度校正液相对应的电位值的参考值，不同系统下会有一定偏差，但如果没有特殊情况，电位值应该在这个范围之内。

下表为校正液浓度为0.1mM时，各离子传感器电位的经验值。

• 配制校正液时，最好采用先配制好较高浓度的母液，然后稀释的方法配制，不要直接溶解固体，因为校正液中的离子浓度一般较低（大多数是0.01mM～1mM），直接用固体配的话称量的量会很少，导致误差增大，校正时不能达到理想值。
• 每种离子的校正液要有一高一低两种浓度，原则上是要将测试液中该离子的浓度包含在内，一般高低浓度相差10倍，比如测试液中Na⁺是0.9mM，校正液就可以是0.5mM和5mM。H⁺的话原理一样，调节高低两种pH即可。
• 校正液中除了待测离子外，还应该有测试液中同浓度的其他离子，pH最好也和测试液一致，如果要测定多种离子，可以配制成同一瓶校正液，但校正液中的待测离子浓度要相应改变。
• 由于不同LIX的选择性不同，所以配制校正液时的离子浓度也是有要求的：

1. H⁺：pH4-pH9之间。
2. Na⁺：10mM—0.5mM，而且溶液中K⁺浓度不要高于Na⁺。
3. K⁺：10mM—0.05mM，且溶液中Na⁺浓度不要高于K⁺。
4. Ca²⁺：10mM—0.05mM，且溶液中最好没有Cd²⁺或者浓度低10倍以上。
5. Mg²⁺：10mM—0.1mM，且溶液中最好没有Cd²⁺和Ca²⁺或者浓度低10倍以上。
6. Cd²⁺：1mM—0.005mM，别的离子基本没什么影响。
7. NH₄⁺：10mM—0.05mM，电位可能不是很稳定，可以选用大开口流速传感器，如果测试中电位变化过大可以多校正或更换LIX。
8. NO₃^-：10mM—0.05mM，Cl^-浓度不要太高。
9. Cl^-：10mM—0.5mM，溶液中不能有其他阴离子，可能需要多次校正。

• 调节校正液的pH需注意，不能用含有待测离子的酸或碱调节，如测定Na⁺时调节pH值不能用NaOH，否则就使溶液中的Na⁺含量增加，可用较少量的KOH调节，最好用氯化胆碱或Tris。

• 非损伤微测系统中的参比电极主要有两个作用：

1. 和流速传感器、测试液、前置放大器一起构成电路回路，
2. 提供一个参考电位。

• 使用时要注意以下几点：

1. 灌充溶液时，要将塑料管连接部分从后端拧下来，从后端用流速传感器灌充液的那种细的注射头灌充溶液，参比内液不要灌充太多，浸没过氯化银丝部分1cm即可。
2. 新灌充3M KCl后，需要让氯化银丝在参比内液中浸泡24小时以上，这样电位稳定得快一些。
3. 灌充溶液时，注意保护好内部银丝尖端的氯化银部分，不要私自用砂纸磨或者剪断。
4. 每次使用完毕后，将参比电极浸泡在3MKCL溶液中（即收纳管内），不要暴露在空气中，如果长时间不使用，需要将塑料管中的溶液全部吸出，再用蒸馏水润洗几遍，晾干后保存。

• 当测试过程中出现电位不正常时，可以首先更换传感器（或LIX），排除传感器问题后，最有可能是参比电极的问题，大概有以下几种情况：

1. 静态电位显示+-5.000V：检查参比电极接口是否插入前置放大器接口中，参比电极是否放入测试液中，参比电极中的溶液是否没过银丝尖端。
2. 校正值在正常范围内，但是比起经验值偏大或偏小（比如低于-150mV,高于500mV等），首先确定测试液和流速传感器灌充液浓度是否正确，之后检查参比电极中的灌充液浓度是否正常，可以重新配制后重新灌充；如果还不行的话，可以更换参比电极的塑料管，新的参比电极附带一个备用的。
3. 当电位变化很快时，除了流速传感器的电位漂移外，还有可能是参比电极漏液造成的，可以更换塑料管试试。

• 参比电极位置应尽量远离样品；最好深入液面5mm；测试时尽量将参比电极相对与样品的位置固定。

• 显微镜放大倍数选择原则：

一般根据样品大小不同，使用不同放大倍数。组织样品较大，则可以根据实际情况，选择较低倍数物镜测定；细胞样品相对较小，为了测量准确，则必须使用较高倍数物镜。

• 测试时需保证流速传感器和样品距离的一致性

测试时流速传感器与样品的距离直接决定着测试信号的大小，尤其是信号大的样品，流速传感器距离样品的距离稍微不同，测出来的信号大小也就不一样，因而要保证每次测试时流速传感器与样品距离的一致性。

• 保证流速传感器与样品距离固定的方法

NMT可以用计算机键盘控制传感器在x、y、z方向进行定距离的运动，运动距离大小可以手动输入确定，显示器也用此方法精确测量了所视范围的长和宽，测试工程师可以每次测试时先在显示器范围内找到样品的固定位置，让流速传感器稍稍贴住样品，然后朝所需方向移动流速传感器，从而达到精确定位的目的。

精确定位程度和显示的放大倍数有关，放大倍数越大越精确，目前可以达到40倍；还与流速传感器移动的最小距离有关，现在流速传感器移动最小可以精确到0.5um。