基本信息

主题：非损伤微测技术发现NAT2促大麦吸Cd 为NAT作为潜在重金属生物修复基因提供证据

期刊：Journal of Advanced Research

影响因子：10.479

标题：An miR156-regulated nucleobase-ascorbate transporter 2 confers cadmium tolerance via enhanced anti-oxidative capacity in barley

作者：浙江大学、扬州大学邬飞波，浙江大学Nian-Hong Wang、Xue-Yi Zhou

 

检测离子/分子指标

Cd²⁺

 

检测样品

大麦根

 

中文摘要

背景：镉（Cd）是最有害的重金属污染物之一，严重影响农作物生产和人类健康。碱基-抗坏血酸转运蛋白（NAT）广泛存在于植物、动物和微生物等多种生物体内;然而，NAT在植物镉耐受性中的作用尚不清楚。

目的：鉴定Cd诱导的靶向HvNAT2的miRNAs，并确定该基因及其产物在Cd耐受性中的作用。

方法:利用高通量测序技术分析大麦根系在Cd胁迫下的miRNA表达谱。然后构建HvNAT2过表达（OX）和RNAi株系，并进行比较转录组学分析，以确定该转运体的功能，研究其对Cd吸收/流速和转运、形态和抗氧化能力等与Cd耐受性相关性状的影响。此外，通过系统发育分析，深入了解HvNAT2的进化过程。

结果：Cd胁迫诱导的miRNA全基因组表达谱鉴定出了一个以HvNAT2为靶标的Cd诱导miR156g-3p_3。HvNAT2在高cd积累和耐HvNAT2镉基因型浙农8号中呈负调控。进化分析表明，定位于质膜的同源序列HvNAT2可追溯到陆地植物的姊妹群—链藻。过表达HvNAT2可提高转基因大麦对Cd的耐受性，提高组织Cd积累量，降低氧化损伤。HvNAT2的RNAi导致镉耐受性显著降低。共聚焦显微镜和电生理学也证实了OX3株系的根中Cd积累量较高。转录组分析表明，HvNAT2增强抗氧化能力与胁迫信号通路有关。此外，HvNAT2-OX植物的氧化胁迫耐受性受到植物螯合素合成和谷胱甘肽代谢周期的调控。

结论：本研究揭示了NAT在植物对镉的耐性中起关键作用的分子机制，这对植物的可持续农业生产和对有害重金属镉的管理具有重要意义，有助于改善环境管理和生态系统功能。

 

离子/分子流实验处理方法

10 μM CdCl₂实时处理

 

离子/分子流实验结果

为了研究不同基因型植株根表皮细胞Cd²⁺流速的影响，研究用非损伤微测技术（MIFE）检测了CdCl₂处理后根表皮细胞Cd²⁺流速动态变化（图1）。结果表明，添加10 μM CdCl₂导致植株表皮细胞Cd²⁺迅速内流；与GP对照相比，HvNAT2-OX3植株的Cd²⁺转运流速最高；HvNAT2-OX3植株的总Cd²⁺流速和平均Cd²⁺流速均显著高于GP（分别为31%和39%），而HvNAT2-RNAi1根部的稳态Cd²⁺流速显著降低了23%。

图1. 10 μM Cd处理后植物根表皮细胞Cd²⁺流速的变化。正值代表离子吸收。

 

其他实验结果

• 大麦中HvNAT2作为耐Cd相关miRNAs靶点的鉴定。研究首先进行了miRNA测序，以确定ZN8中Cd耐受性的miRNA及其预测靶基因；在与Cd处理相关的miRNAs中，miR156g-3p_3被Cd处理上调，而在W6nk2中没有变化，表明其可能参与了植株对Cd应激响应；miR156g-3p_3的一个靶基因被确定为HvNAT2，其蛋白参与氧化还原反应；因此，我们对HvNAT2进行了进化和功能探索；该miRNA被预测可以切割产物的5’端；Cd处理可快速诱导HvNAT2的表达，在Cd胁迫后1h达到最高表达量，然后逐渐下降。

• 质膜NAT2是一种由藻类进化而来的碱基抗坏血酸转运体。利用OneKP植物转录组数据库中的序列，研究发现HvNAT2在植物和藻类的主要谱系中存在同源性；HvNAT2可被归入Ⅱ亚家族，被预测为对氧化嘌呤、黄嘌呤和尿酸具有高亲和力的转运体，但不是抗坏血酸；此外，HvNAT2在叶片中的表达水平高于茎和根；烟草叶片表皮中的亚细胞定位分析表明，HvNAT2定位于质膜上；大麦组织的原位PCR检测表明，DIG染色信号几乎分布于所有的根细胞部位，但在维管束中表达略多；在叶片中，HvNAT2主要在维管束中表达，特别是在韧皮部细胞中表达。

• 过表达HvNAT2增强了大麦的Cd耐受性。为了证实HvNAT2的功能，研究构建了3个独立过表达系HvNAT2-OX1、HvNAT2-OX2和HvNAT2-OX3；在对照条件下和Cd处理下，OX株系中HvNAT2的转录水平分别平均比GP高37倍和34倍；与对照相比，Cd处理30 d使GP植株干重降低60.2%，OX系相应降低43.5%；在Cd胁迫下，OX株系的叶绿素含量、分蘖数、总根长、根体积和根尖数均显著高于GP；在Cd胁迫下，HvNAT2过表达导致地上部分和根部Cd浓度分别显著提高了45.7%和51.3%。

• 抑制HvNAT2降低了大麦对镉的耐受性。随后，研究使用两个RNAi株系(HvNAT2-RNAi1和HvNAT2-RNAi2)检测了HvNAT2的功能；与对照组相比，HvNAT2-RNAi1和HvNAT2-RNAi2中HvNAT2表达的降低导致Cd敏感表型；15 d Cd处理后，HvNAT2-RNAi系的茎干重平均降低了40.1%和55.3%，而GP的干重分别为22.0%和28.9%；HvNAT2 RNAi株系的根系Cd浓度和植株Cd积累均显著降低，但其根部向地上部的Cd转运率显著高于GP。

• HvNAT2调节氧化还原相关基因的表达，以增强大麦对Cd的耐受性。为了揭示HvNAT2调控大麦对Cd的耐受机制，在对照和Cd胁迫下，对GP和HvNAT2-OX株系进行了转录组分析；GO分析表明，DEGs主要参与细胞过程、代谢过程、分子功能调控、刺激反应、信号转导和氧化还原等相关的ROS调控；KEGG富集结果表明，这些DEGs主要参与植物-病原体相互作用、mRNA监测通路、有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)信号通路以及淀粉和蔗糖代谢；与GP相比，OX株系中参与氧化还原(如GSTs、GPXs、AOX、AAO)、MAPK信号、乙烯信号和膜转运(如HMA3、ERD4、ACA)相关基因差异表达；这些结果表明，提高抗氧化能力可能是OX株系耐Cd的重要途径；进一步研究表明，Cd胁迫下，HvNAT2-OX株系的SOD、POD、GPX和APX活性增加，均显著高于GP；虽然Cd胁迫没有引起GST活性的增加，但OX株系在对照组和Cd条件下均表现出较高的GST活性；在Cd胁迫下，HvNAT2-OX株系的GSH含量高于GP；Cd胁迫下，GP地上和根部的MDA含量分别比对照增加了74.8%和95.3%，HvNAT2-OX系的MDA含量分别降低到49.2%和54.1%；过表达HvNAT2对地上部NO含量的影响不大，但HvNAT2-OX株系的根系中Cd诱导的NO含量的增加显著高于GP。

 

结论

综上所述，本研究报道了miR156g-3p_3靶向一个新的NAT基因HvNAT2，该基因已被功能表征，确定其在大麦Cd耐受性中的发挥作用。过表达HvNAT2增强了植株对Cd的耐受性，OX株系具有较高的抗氧化基因表达、ROS酶活性和GSH含量。转录组学分析显示，抗氧化能力的增强是由于MAPK和乙烯信号通路的激活、多胺合成的增加以及GSH-GSSG循环活性的增强。因此，由于NAT2具有高度的进化保守性，植物和绿藻中的NAT基因工程可能在土壤和水体Cd污染的修复中具有潜力，为粮食生产提供更安全、更清洁的土壤环境。

 

测试液

0.5 mM KCl, 0.01 mM CaCl₂, 0.01 mM CdCl₂, pH 6.0

 

文章原文：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123222000820?via%3Dihub

 

标签: Cd2+, microRNA, RNA序列, 大麦, 植物类, 氧化信号, 镉毒性