非损伤微测技术(NMT) 知识库 - MP山师王宝山：在体单细胞盐腺泌Na+检测技术 NMT为盐生植物抗盐适应演化机制提供证据

ID #1302

MP山师王宝山：在体单细胞盐腺泌Na+检测技术 NMT为盐生植物抗盐适应演化机制提供证据

~ 0 min

xuyuenmt

2022-07-05 11:50

基本信息

主题：在体单细胞盐腺泌Na⁺检测技术 NMT为盐生植物抗盐适应演化机制提供证据

期刊：Molecular Plant

影响因子：13.164

研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台

标题：The genome of the recretohalophyte Limonium bicolor provides insights into salt gland development and salinity adaptation during terrestrial evolution

作者：山东师范大学王宝山、陈敏、袁芳、王茜、赵博庆、徐晓静、北京贝瑞和康生物技术有限公司史淼

检测离子/分子指标

Na⁺

检测样品

二色补血草盐腺

中文摘要

盐生植物会进化出专门应对高盐度的方式。极端盐生植物二色补血草（Limonium bicolor）表皮缺乏毛状体，但有盐腺，可排出钠等有害离子，避免盐害。本文利用Illumina短序列、单分子实时长序列、染色体构象捕获（Hi-C）数据和Bionano基因组图谱，报道了一个高质量、2.92Gb染色体规格的二色补血草基因组组装，极大地丰富了具有多细胞盐腺的泌盐盐生植物的基因组信息。虽然二色补血草基因组具有与拟南芥（Arabidopsis thaliana）毛状体命运基因相似的基因，但其与命运决定基因GLABRA3、ENHANCER of GLABRA3、GLABRA2、TRANSPARENT TESTA GLABRA2和SIAMESE缺乏同源性，为该物种缺乏毛状体提供了分子解释。在毛状体经典同源基因中，发现了控制盐腺发育的关键基因LbHLH和LbTTG1的突变显著破坏了盐腺的启动、盐的分泌和盐的耐受性。这为长期存在的盐腺和毛状体可能有共同起源的假设提供了基因支持。此外，二色补血草在与苦荞麦分化后发生了全基因组复制事件，这可能是苦荞适应高盐环境的原因之一。二色补血草的基因组资源为植物耐盐机制的研究提供了丰富的信息，有助于耐盐作物的工程化。

离子/分子流实验处理方法

WT、Mock-CR、Mock-OE、Lbttg1-cr、Lbhlh-cr、LbTTG1-OE、LbHLH-OE株系

离子/分子流实验结果

本研究其他结果表明，LbTTG1和LbHLH参与盐腺的发育，影响盐腺密度和外观。此外，CR和OE株系的作用方向表明这两种蛋白在盐腺发育中起到负作用。为了确定OE和CR株系中观察到的异常盐腺（或大或小）是否仍具有功能，研究使用非损伤微测技术（non-invasive microtest technology, NMT）精确测量了单个盐腺的Na⁺外排速率。该实验设备可以直接捕捉到单个盐腺，并清楚地看到它们的不同大小：WT、Mock-CR和Mock-OE系的正常盐腺，Lbttg1-cr和Lbhlh-cr的大盐腺，以及LbTTG1-OE和LbHLH-OE系的小盐腺（图1A）。在盐腺上方约30 μm处检测到Na⁺流出，与盐腺的泌盐功能一致（图1B）。研究记录了360 s内单个盐腺的Na⁺外排速率（图1B）。结果显示，无论是Lbttg1-cr和Lbhlh-cr株系的大盐腺，还是LbTTG1-OE和LbHLH-OE系的小盐腺都持续分泌Na⁺，其分泌功能与正常盐腺相同，而扁平细胞（WT-PC）没有分泌任何Na⁺。而且，Lbttg1-cr和Lbhlh-cr株系的大盐腺比WT或Mock株系的盐腺表现出更高的Na⁺外排速率，而LbTTG1-OE和LbHLH-OE的小盐腺则表现出更低的Na⁺分泌率（图1C）。

图1. 不同株系的单个盐腺的Na⁺外排速率。正值代表离子外排。

其他实验结果

二色补血草的基因组最终大小为2.92 Gb，组装的质量和完整性相对较高。
为了进行比较基因组学分析，研究选取了10个物种，利用1078个单基因家族的数据构建了系统发育树，结果显示二色补血草和苦荞麦的亲缘关系最为密切，并且早于苦荞麦出现。然而，由于苦荞麦（454 Mb）和二色补血草的（2.92 Gb）基因组大小和复杂程度的差异，研究观察到两个基因组之间没有明显的共线性。
拟南芥与毛状体发育相关的70个已知基因与二色补血草中在盐腺中高表达的286个同源基因表现出高度相似性，这增加了二色补血草中毛状体发育程序可能被阻断或修饰，从而产生盐腺而不是毛状体以适应盐度的可能性。
盐腺和毛状体可能具有相似的祖先。
原位杂交证实了LbTTG1和LbHLH均在盐腺中表达。
与WT和Mock株系相比，LbTTG1-cr株系中的LbTTG1表达明显较低，而在LbTTG1-OE株系中则较高。LbHLH在各自的CR和OE株系中观察到的相似表达模式。
研究对所有株系中盐腺的密度和外观进行了评分。含有空CRISPR或过表达载体的株系，虽然盐腺面积在一定程度上增大，但相对于WT，盐腺密度并没有发生变化。
LbTTG1或LbHLH在二色补血草中的过表达和基因失活导致了相似的盐腺表型。Lbttg1-cr和Lbhlh-cr株系的盐腺密度高于WT，而LbTTG1-OE和LbHLH-OE过表达株系的盐腺密度低于WT。盐腺形态也受到明显影响。相比之下，Lbttg1-cr和Lbhlh-cr株系出现多个自体荧光灶（大盐腺），而LbTTG1-OE和LbHLH-OE过表达株系出现两个或三个自体荧光灶（小盐腺）。另外还观察到，CR或OE株系与WT和Mock株系的异常盐腺比例差异显著。
经过7 d的200 mM NaCl处理后，与WT和Mock株系（CR和OE）相比，Lbttg1-cr和Lbhlh-cr两个株系比盐处理前表型增强，具体表现在全株叶片和根系发育上。NaCl处理前后测定根长和单叶面积。尽管盐处理后所有株系均表现出根系伸长和叶片展开明显，但Lbttg1-cr在这两个指标的增加率上均显著优于LbTTG1-OE，Lbhlh-cr的增加率也高于LbHLH-OE。这说明盐处理下CR株系的生长速度明显快于OE株系。
CR株系比OE株系遭受的氧化损伤和质膜损伤更少。此外，对盐处理后的叶片Na⁺含量进行了测定，发现OE株系叶片Na⁺积累量最大，CR株系叶片Na⁺积累量最小。结合表型和生理指标，NaCl处理显著促进了CR株系的生长，叶片中Na⁺积累量降低，氧化损伤和质膜损伤加剧，这可能与CR株系盐分分泌增强有关。这些结果表明，CR系盐腺发育的促进确实增加了盐分泌量和耐盐性。
利用酵母双杂（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）检测到LbTTG1和LbHLH之间存在强烈的相互作用，表明LbTTG1可以与LbHLH形成复合物，共同调节盐腺发育。
鉴于LbTTG1和LbHLH都有助于二色补血草的盐腺发育，并且它们的同系物TTG1和GL3决定了拟南芥的毛状体命运，假设毛状体和盐腺发育存在类似的调节机制。研究测试了LbHLH是否可以替代拟南芥GL3来诱导毛状体。为了避免GL3和EGL3在毛发启动过程中的冗余，研究在gl3单突变体和gl3-1 egl3-1双突变体中引入了一个在35S启动子控制下驱动LbHLH表达的结构。尽管单个gl3或egl3突变体形成了一些毛状体，但LbHLH的过表达均未能诱导双突变体形成毛状体，与LbHLH的表达水平如何，说明LbHLH不能补偿GL3和EGL3的损失。此外，LbHLH的异源表达也未能促进gl3单一突变体中的毛状体形成，表明LbHLH不能替代拟南芥GL3。研究认为，编码GL3样蛋白的基因的缺失可能直接导致二色补血草中毛状体的缺失。LbHLH可能在二色补血草的盐腺发育中发挥重要作用，并可能与其他未知因素相互作用，启动盐腺分化。

结论

在拟南芥中，GL1、GL3、EGL3和TTG1形成MYB-BHLH-WD-repea(MBW)激活复合物，激活GL2/TTG2和RBR1/SIM的转录，促进毛状体形成。这些结果表明，在二色补血草中，LbTTG1和LbHLH基因相互作用，负向参与盐腺发育。研究鉴定了GL1、RBR1、CPC、TRY和TCL1的同源基因（LbGL1、LbRBR1、LbCPC、LbTRY和LbTCL1）。而GL3、EGL3、GL2、TTG2和SIM均未检测到同源基因，这可能是二色补血草缺乏毛状体的原因。相反，盐腺的发育可能受这些毛状体同源基因的调控，这些同源基因可能与其他特定的候选基因协同调控盐腺的进一步发育。这些结果暗示了盐腺和毛状体可能具有潜在的相似的分化机制，对于揭示陆生植物叶片的原表皮细胞如何适应陆地盐碱和干旱等生境而分化形成盐腺和毛状体具有重要理论意义，也对作物抗盐性状的改良并最终培育具有盐腺的抗盐作物具有重大的现实意义和应用前景。